50020070215. El receptor endotelial de la proteA�na c y su papel en la trombosis arterial y venosa

El sistema anticoagulante de la proteA�na C

La hemostasia sanguA�nea comprende un conjunto de mecanismos que mantienen la integridad del sistema vascular para prevenir la pA�rdida de sangre tras una lesiA?n, asegurando ademA?s que el tapA?n hemostA?tico no persista mA?s tiempo que el necesario y que no se forme en los lugares donde no existe lesiA?n.

De la formaciA?n del coA?gulo se encargan las plaquetas (hemostasia primaria) y la coagulaciA?n; de que el tamaA�o del coA?gulo no sea excesivo y no perdure se encargan los sistemas anticoagulantes y la fibrinolisis, respectivamente. La mayor parte de las molA�culas que integran estos mecanismos se conoce desde hace tiempo, y se han caracterizado bioquA�micamente una gran parte de las reacciones en las que intervienen.
La reacciA?n clave de la coagulaciA?n consiste en la transformaciA?n del fibrinA?geno (soluble) en fibrina (insoluble) por acciA?n de la trombina, enzima proteolA�tica que se forma por la activaciA?n de la protrombina. Para prevenir la oclusiA?n del A?rbol vascular por la propagaciA?n del coA?gulo, el sistema de la coagulaciA?n estA? regulado cuidadosamente por diversos mecanismos anticoagulantes, como el sistema de la proteA�na C.

El sistema de la proteA�na C es un sistema anticoagulante a�?latentea�? o de reserva que se activa en la medida en que se activa la coagulaciA?n, de tal modo que la capacidad anticoagulante es proporcional al grado de generaciA?n de trombina: una vez generada, la trombina realiza su actividad coagulante pero tambiA�n puede unirse a la trombomodulina, receptor presente en la superficie del endotelio a no ser que A�ste estA� lesionado (por lo tanto, presente donde no se precisa la formaciA?n de un coA?gulo, sino donde es necesario mantener la fluidez de la sangre).

La trombina unida a la trombomodulina pierde sus propiedades procoagulantes y adquiere la capacidad de activar proteA�na C que, una vez activada y en presencia de proteA�na S, degrada los factores V y VIII activados y de este modo detiene la generaciA?n de mA?s trombina, evitando asA� que la formaciA?n del coA?gulo se propague a regiones del A?rbol vascular donde A�ste no es necesario (figura 1A).

Figura 1A. ActivaciA?n de la proteA�na C por la trombina sobre las cA�lulas endoteliales. Se seA�ala el dominio Gla (Gla) de la proteA�na C (PC) y de la proteA�na C activada (PCA). El panel A muestra la activaciA?n de la proteA�na C en la membrana de la cA�lula endotelial tras su uniA?n con el complejo formado por la trombina (T) y la trombomodulina (TM). El panel B muestra cA?mo la generaciA?n de PCA es mayor cuando el EPCR, uniA�ndose a la proteA�na C a travA�s de su dominio Gla, presenta a A�sta al complejo trombina-trombomodulina.

La activaciA?n de la proteA�na C por el complejo trombina-trombomodulina es una reacciA?n poco eficiente con una constante de Michaelis-Menten (Km) de 1 i?�mol/L, unas 15 veces mA?s alta que la concentraciA?n plasmA?tica de proteA�na C (65 nmol/L) (1), lo que quiere decir que, a concentraciones fisiolA?gicas de proteA�na C, es necesaria una concentraciA?n muy elevada de trombomodulina para que la reacciA?n de activaciA?n de la proteA�na C pueda ser biolA?gicamente importante (2). Como la relaciA?n superficie endotelial/volumen de sangre es 1.000 veces mA?s elevada en la microcirculaciA?n que en los grandes vasos, la concentraciA?n efectiva de trombomodulina serA�a suficientemente elevada para activar la proteA�na C en la microcirculaciA?n, pero no en los vasos mA?s grandes (3).

De acuerdo con el modelo de activaciA?n de la proteA�na C en la microcirculaciA?n, es difA�cil explicar por quA� el dA�ficit moderado de proteA�na C predispone a la trombosis venosa profunda y no a la trombosis de la microcirculaciA?n (4, 5, 6). Para lograr que siempre haya una cantidad mA�nima necesaria de PCA circulante, el hecho anterior se ve compensado de dos maneras diferentes: en determinados territorios vasculares la concentraciA?n de trombomodulina se incrementa en gran medida (3); en otras A?reas, se logra aumentar la afinidad de la proteA�na C por el complejo trombina-trombomodulina gracias a la alta tasa de expresiA?n del receptor endotelial de la proteA�na C (EPCR) (figura 1B), A?ltima molA�cula identificada de este sistema y cuyo descubrimiento ha revolucionado el conocimiento de las acciones biolA?gicas de la proteA�na C (7, 8).

El receptor endotelial de la proteA�na C (EPCR)

El receptor endotelial de la proteA�na C es una glicoproteA�na que se expresa en la membrana de las cA�lulas endoteliales, compuesta por 221 aminoA?cidos despuA�s de la eliminaciA?n de un residuo de 17 aminoA?cidos (pA�ptido seA�al) durante el proceso de maduraciA?n (9). El peso molecular es de 45 kDa y presenta cadenas de carbohidratos en los 4 sitios potenciales de N-glicosidaciA?n. El EPCR liga de manera especA�fica y con una relativamente alta afinidad (Kd ~ 30 nM) la proteA�na C y la proteA�na C activada de una manera calcio y magnesio dependiente (9). EstA? codificada por un gen localizado en el brazo largo del cromosoma 20 (20q11.2) formado por 4 exones interrumpidos por tres intrones (10, 11, 12) (figura 2).

Figura 2. OrganizaciA?n del gen del EPCR y su secuencia proteica. La barra en negro indica los exones I al IV separados por los intrones 1 a 3. La secuencia proteica viene marcada en la parte inferior por recuadros en los que se seA�ala la posiciA?n de los aminoA?cidos codificados por cada exA?n. Se muestra el pA�ptido seA�al como un recuadro punteado; los dominios alfa 1 (I�1) y I�2 incluidos en la regiA?n extracelular aparecen en lA�neas discontinuas horizontales y verticales, respectivamente; el dominio transmembrana, en lA�neas discontA�nuas onduladas y el dominio citoplasmA?tico, en lA�neas oblicuas.

El EPCR adquiere una estructura secundaria caracterizada por una plataforma formada por siete u ocho hojas plegadas I? sobre la que se apoyan dos regiones con conformaciA?n en I� hA�lice que forman un bolsillo en el que se aloja un fosfolA�pido (13, 14). La regiA?n apical es la mA?s implicada en la interacciA?n con la proteA�na C (figura 3).

Figura 3. Estructura tridimensional del EPCR. El panel A muestra el dominio extracelular del EPCR que se dispone formando una plataforma compuesta por ocho hojas plegadas b sobre la que se apoyan dos regiones con conformaciA?n en hA�lice a. El panel B muestra la misma estructura con un giro de 90A? respecto al eje de coordenadas tridimensional Z.

El receptor endotelial de la proteA�na C aumenta la tasa de activaciA?n de la proteA�na C en la superficie endotelial

Cuando la proteA�na C se une al EPCR, se aumenta la reacciA?n de activaciA?n de la proteA�na C por el complejo trombina-trombomodulina. En la superficie de cA�lulas que expresan trombomodulina y EPCR, se ha podido demostrar que la tasa de generaciA?n de proteA�na C activada es aproximadamente nueve veces mA?s elevada que sobre cA�lulas que no expresan EPCR. Este fenA?meno desaparece al bloquear el EPCR con anticuerpos monoclonales (15, 16).

La tasa de activaciA?n de proteA�na C aumenta con el incremento de concentraciA?n de EPCR, y no se satura aunque la relaciA?n EPCR/trombomodulina sea 14/1, el doble de la presente en la superficie de las cA�lulas endoteliales, lo cual quiere decir que el contacto fA�sico entre trombomodulina y EPCR es mA�nimo o nulo (17). AdemA?s, se sabe que la trombomodulina y EPCR se localizan en una misma zona de la membrana celular (18, 19, 20), y este hecho podrA�a favorecer las interacciones entre la proteA�na C y el complejo trombina-trombomodulina (21).

BioquA�micamente el aumento de generaciA?n de proteA�na C activada en presencia de EPCR se debe principalmente a que el EPCR reduce la Km de la reacciA?n de activaciA?n de proteA�na C de 1 I?M en ausencia de EPCR a 20 nM en presencia de EPCR (15, 16), convirtiendo una reacciA?n con muy baja afinidad en una reacciA?n de alta afinidad que es eficaz a las concentraciones fisiolA?gicas de proteA�na C. El EPCR liga con alta afinidad la proteA�na C en la proximidad del complejo trombina-trombomodulina y de este modo la presenta eficazmente al citado complejo y permite que su activaciA?n sea mA?s eficaz.

El EPCR se expresa principalmente en el endotelio de los grandes vasos arteriales y venosos

Con los datos disponibles en la actualidad, el EPCR parece ser que se expresa exclusivamente en las cA�lulas endoteliales y en el trofoblasto (7, 22, 23). Estudios inmunohistoquA�micos realizados en el hombre y en babuinos han demostrado que la expresiA?n del EPCR es muy importante en el endotelio de los grandes vasos, particularmente en las arterias y disminuye paulatinamente al disminuir el tamaA�o de los vasos, hasta ser prA?cticamente indetectable en el endotelio de la mayorA�a de los capilares (24).

La expresiA?n de la trombomodulina en la superficie endotelial es uniforme a lo largo de todo el A?rbol vascular, de tal modo que la concentraciA?n de trombomodulina es alta en la microcirculaciA?n y muy baja en los vasos de mediano y gran calibre por las razones geomA�tricas seA�aladas anteriormente. Es aquA� donde estA? presente el EPCR, permitiendo de este modo la activaciA?n de proteA�na C en los grandes vasos venosos y arteriales. En un intento de unificar todos estos datos descritos hasta ahora, se propone un modelo de activaciA?n de la proteA�na C (17).

En la microcirculaciA?n, donde la trombomodulina es muy abundante y no existe EPCR, la activaciA?n de la proteA�na C se produce porque el complejo activador trombina-trombomodulina es muy abundante; la afinidad de la proteA�na C por el complejo trombina-trombomodulina es baja pero el exceso de esta A?ltima permite la activaciA?n incluso en caso de una dismininuciA?n moderada de proteA�na C. Sin embargo, en caso de ausencia completa de proteA�na C se produce trombosis de la microcirculaciA?n. En los vasos de mayor calibre, donde la concentraciA?n de trombomodulina es baja, la expresiA?n de EPCR aumenta la afinidad de proteA�na C por el complejo activador permitiendo la activaciA?n de la proteA�na C, en este caso el sistema serA�a muy sensible a las variaciones de concentraciA?n de proteA�na C y esto explicarA�a la trombosis venosa profunda en caso de dA�ficit moderado de proteA�na C.

De acuerdo con este esquema, es posible que la disminuciA?n de la activaciA?n de la proteA�na C por los defectos de EPCR sea un factor de riesgo para la trombosis venosa profunda y muy probablemente para la arterial, donde el EPCR parece tener una importante misiA?n al aumentar la generaciA?n de proteA�na C activada.

Autoanticuerpos anti-EPCR

Desde el punto de vista clA�nico, las trombosis pueden ser de cualquier territorio vascular, aunque las mA?s frecuentes son la trombosis venosa profunda (TVP), la trombosis arterial cerebral y el infarto agudo de miocardio (IAM). En el caso de las mujeres, es frecuente que el SAF se manifieste como complicaciones obstA�tricas, probablemente relacionadas con trombosis de la circulaciA?n placentaria, que pueden conducir a muerte fetal, abortos de repeticiA?n y niA�os prematuros. Con frecuencia, estas patologA�as van acompaA�adas de la presencia de autoanticuerpos como anticardiolipina (ACL), autoanticuerpos que originan el fenA?meno anticoagulante lA?pico (AL) y otros, que con mucha frecuencia son capaces de reconocer fosfolA�pidos, fosfolA�pidos unidos a proteA�nas o sencillamente proteA�nas que se unen a fosfolA�pidos.

Llama la atenciA?n que dichas patologA�as se manifiestan muy frecuentemente como trombosis en las regiones donde mA?s se expresa el EPCR: lecho vascular de grandes vasos arteriales y venosos asA� como el sincitiotrofoblasto de la placenta. Por el hecho de formar un complejo con un fosfolA�pido sobre la superficie de la cA�lula endotelial y del sincitiotrofoblasto, el EPCR es candidato a ser una diana para autoanticuerpos. A�stos autoanticuerpos podrA�an dificultar la activaciA?n de la proteA�na C o activar sistemas inflamatorios como el complemento. Por tanto, se hace atractiva la hipA?tesis de que las concentraciones elevadas de anti-EPCR pueden consituir un factor de riesgo en patologA�as trombA?ticas.

En la Unidad de InvestigaciA?n en Trombosis y Hemostasia del Centro de InvestigaciA?n MA�dica Aplicada (CIMA) de la Universidad de Navarra, dirigida por los Dres. JosA� Hermida y RamA?n Montes, se quiso poner a prueba esta hipA?tesis, lo que les llevA? a desarrollar un sistema de detecciA?n de estos autoanticuerpos en suero y plasma (25) y detectaron la presencia de autoanticuerpos anti-EPCR en pacientes que habA�an sufrido algA?n tipo de proceso trombA?tico. Ello les llevA? a optimizar dicho sistema que ahora les permite estudiar la implicaciA?n de autoanticuerpos anti-EPCR en diferentes patologA�as en las que se dan procesos trombA?ticos.

ELISA para la determinaciA?n de anticuerpos anti-EPCR

Se optA? por un inmunoensayo tipo ELISA. Para la realizaciA?n de un inmnunoensayo para detectar anticuerpos anti-EPCR en sueros humanos se necesita obtener primero un sEPCR (fragmento soluble del EPCR) humano recombinante. Para la producciA?n de la proteA�na recombinante se ha utilizado un sistema de expresiA?n en levaduras, en concreto Pichia pastoris, que tiene facilidad para la manipulaciA?n molecular y genA�tica y tiene la ventaja adicional de ser capaz de producir entre diez y cien veces mA?s cantidad de proteA�nas heterA?logas recombinantes que otros sistemas, lo cual hace de ella un A?ptimo sistema de expresiA?n. Pichia pastoris tiene una gran tendencia a insertar de forma adecuada entre su genoma un DNA exA?geno introducido artificialmente, lo cual facilita la inserciA?n de vectores en su genoma.

En este caso se ha empleado el vector pPIZCI�C en el que previamente se integra la secuencia de la proteA�na recombinante. Este vector contiene como componentes mA?s destacables el gen que codifican para un pA�ptido que permitirA? la secreciA?n extracelular de la proteA�na recombinante (factor I�), un gen de resistencia a un antibiA?tico (zeocina) que servirA? para seleccionar las colonias que han integrado el vector, y el gen del sEPCR seguido de las secuencias que codifican el epA�tope c-myc y seis histidinas (figura 4). Al cultivar la levadura se obtiene una proteA�na recombinante sEPCR unida a un epA�tope c-myc y seis histidinas en el extremo carboxilo. Las seis histidinas ayudan en el proceso de purificaciA?n de la proteA�na recombinante y el epA�tope c-myc, al poder ser detectado por anticuerpos especA�ficos, facilitarA? el diseA�o del ELISA como mA?s tarde veremos.

Figura 4. Estructura del plA?smido pPICZi??C. Se seA�alan las secuencias codificadas por el vector: el promotor del gen AOX (5A?AOX1), a continuaciA?n el factor I� (I�-factor) seguido de la caja de clonaje, donde se inserta la secuencia codificante de la proteA�na recombinante, y finalmente el epA�tope c-myc, seis histidinas y el codA?n stop que acompaA�a a la regiA?n terminal de transcripciA?n del gen AOX1 (AOX1 TT). TambiA�n aparecen los promotores PTEF1 y PEM7 y la regiA?n terminal de transcripciA?n del gen CYC1 (CYC1 TT) procedentes de Saccharomyces cerevisae que permiten la correcta expresiA?n del gen de la resistencia a la zeocina, el origen de replicaciA?n pUC utilizado para la replicaciA?n del plA?smido en E. coli y las dianas de restricciA?n Bgf II, BamH I y Xho que linealizan el vector.

Una vez construA�do el vector, introducido en la levadura Pichia pastoris y cultivada A�sta para obtener un caldo en el que entre otras cosas estA? el sEPCR que interesa, hay que purificar la proteA�na. Las seis histidinas que el sEPCR posee en su extremo carboxiterminal facilitan enormemente la purificaciA?n, gracias a la gran afinidad por los metales divalentes que estos aminoA?cidos confieren a la proteA�na.

Por este motivo, se utiliza una estrategia de purificaciA?n en tres pasos que consiste en una cromatografA�a de afinidad en cobre (figura 5), como primer paso; eliminada asA� la mayorA�a de contaminantes, se completa la purificaciA?n con un intercambio iA?nico (figura 6) y una exclusiA?n en gel por peso molecular (figura 7). Al finalizar cada uno de los pasos de intercambio iA?nico y exclusiA?n en gel, se comprueba que lo que se tiene es sEPCR mediante un estudio de immunoafinidad con anticuerpos especA�ficos (figuras 6C y 7C).

Figura 5. PurificaciA?n del sEPCR mediante cromatografA�a de afinidad en cobre. Se representa el perfil del cromatograma a 280 nm. El primer pico, ancho, corresponde a la eluciA?n en PBS de las proteA�nas que no presentan afinidad por el Cu2+; tras la sustituciA?n del PBS por EDTA se observa un pico mA?s alto y mA?s estrecho, que corresponde a las proteA�nas ricas en histidinas, entre ellas el sEPCR.
mUA (280 nm): unidades de absorbancia a 280 nm, multiplicados por 1.000; mL: volumen de eluciA?n.

Figura 6. PurificaciA?n del sEPCR mediante cromatografA�a de intercambio iA?nico. El panel A muestra el perfil del cromatograma a 280 nm. Se observa cA?mo, al cargar la mezcla proteica en la columna, salen primero las proteA�nas no aniA?nicas (pico 1), y cA?mo eluyen diferencialmente las cargadas negativamente conforme se aplica el gradiente de NaCl (pico 2-5). Los paneles B y C muestran las caracterA�sticas de los picos de proteA�nas obtenidos tras la eluciA?n diferencial con NaCl, mediante electroforesis (SDS-PAGE) en gel de poliacrilamida en gradiente (4 – 12%) teA�ido con azul de Coomassie (B) y Western-blot con RCR-2 (C).

mUA (280 nm): unidades de absorbancia a 280 nm, multiplicados por 1.000; mL: volumen de eluciA?n; lA�nea discontA�nua: gradiente de NaCl. Calles 1a��5: pico 2; calles 6a��9: pico 3; calle 10: pico 4.

Figura 7. PurificaciA?n del sEPCR mediante cromatografA�a de exclusiA?n en gel. El panel A muestra el perfil del cromatograma a 280 nm. Se observa cA?mo, al cargar la mezcla proteica en la columna, sale primero el sEPCR (pico 1) seguido de otras contaminaciones de menor peso molecular (pico 2 y 3). Los paneles B y C muestran las caracterA�sticas de los picos de proteA�nas obtenidas tras la eluciA?n diferencial en funciA?n de su peso molecular, mediante electroforesis (SDS-PAGE) en gel de poliacrilamida en gradiente (4 – 12%) teA�ido con azul de Coomassie (B) y Western-blot con RCR-2 (C).

mUA (280 nm): unidades de absorbancia a 280 nm, multiplicados por 1.000; mL: volumen de eluciA?n; PM, marcador de peso molecular (kDa); calle 1: pico 2; calles 2 y 3: picos 2 y 3, respectivamente.

Ya se tiene la proteA�na recombinante para diseA�ar el ELISA que detectarA? autoanticuerpos anti-EPCR. El inmunoensayo serA? de la siguiente manera (figura 8).

Figura 8. Esquema del ELISA para detectar autoanticuerpos anti-EPCR. El anticuerpo (Ac) anti-myc, fijado al fondo del pocillo, reconoce al epA�tope c-myc del sEPCR, que serA? reconocido por los autoanticuerpos anti-EPCR del suero o plasma. Finalmente, la adiciA?n de Ac dirigidos frente a las IgA, M o G humanas permitirA? la detecciA?n de Ac anti-EPCR de los citados isotipos.

Se tapizan microplacas de 96 pocillos con un anticuerpo monoconal anti-myc. Sobre este anti-myc se echa la proteA�na recombinante sEPCR con su cola c-myc, gracias a la cual la proteA�na se une a los anticuerpos. Se aA�aden a continuaciA?n las muestras de suero o plasma de las que queremos saber si hay autoanticuerpos anti-EPCR.
Por A?ltimo se utilizan anticuerpos dirigidos contra inmunoglobulinas humanas conjugados con una enzima, la peroxidasa. AA�adiendo a la enzima el sustrato adecuado, se produce una reacciA?n colorimA�trica. Solamente se verA? color en aquellos pocillos en los que la muestra de suero o plasma aA�adido tenga anticuerpos anti-EPCR, y la intensidad del color serA? mayor cuantos mA?s anticuerpos anti-EPCR haya en la muestra.

La intensidad de color se mide por absorbancia en un lector de microplacas. Al estar el EPCR fusionado con un epitope c-myc, y anclado al fondo del pocillo de la microplaca a travA�s de este epA�tope mediante un anticuerpo monoclonal anti-myc previamente ligado a la superficie del pocillo, el EPCR mantiene su estructura tridimensional y en consecuencia expone todos sus posibles epA�topes susceptibles de ser reconocidos por los autoanticuerpos, a diferencia de lo que ocurrirA�a si se une el EPCR directamente, pues su uniA?n con el plA?stico distorsionarA�a su estructura induciendo la desapariciA?n de posibles epA�topes.

Por estos motivos y por el elevado grado de pureza logrado con el proceso de purificaciA?n mediante tres pasos de cromatografA�a lA�quida se dispone de un ELISA que puede detectar potencialmente todos los autoanticuerpos dirigidos frente a la regiA?n extracelular del EPCR y sA?lo los dirigidos frente a A�l. El sistema puesto a punto es sA?lido y fiable pues la repetibilidad es muy alta, con unos coeficientes de variaciA?n intra e inter ensayo por debajo del 10% lo que ha permitido a los doctores JosA� Hermida y RamA?n Montes estudiar la presencia de autoanticuerpos anti-EPCR y su papel como factor de riesgo en tres patologA�as trombA?ticas: el sA�ndrome antifosfolA�pido (SAF), muerte fetal e infarto agudo de miocardio (IAM) (25, 26).

Autoanticuerpos anti-EPCR en el sA�ndrome antifosfolA�pido (SAF)

Como inicio de estas investigaciones, para comprobar si existA�a, si se podA�a detectar, en la patologA�a humana, algA?n autoanticuerpo anti-EPCR parecA�a que la patologA�a donde mA?s probabilidades existA�an de encontrar algA?n autoanticuerpo serA�a el SAF, pues A�ste es un trastorno autoinmune con manifestaciones trombA?ticas y se estaba buscando la presencia de autoanticuerpos, manifestaciA?n de una enfermedad autoinmune, que podrA�an lesionar el endotelio y el sistema anticoagulante de la proteA�na C, que como ya hemos dicho juega un papel importante en la prevenciA?n de la trombosis.

El grupo estudiado estaba formado por 43 pacientes con SAF cuyas edades estaban comprendidas entre los 17 y 67 aA�os (mediana: 44 aA�os) de los cuales 39 eran mujeres y cuatro hombres. Para que un paciente fuera incluido en el estudio debA�a cumplir los siguientes dos criterios: presencia de anticoagulante lA?pico (AL) y antecedentes personales de trombosis, independientemente de que fuera arterial o venosa. Por lo tanto, todos ellos cumplA�an los criterios de Sapporo de SAF (27). 17 pacientes sufrieron trombosis venosa, 13 trombosis arterial y 13 sufrieron ambos tipos. 27 de ellos fueron diagnosticados de lupus eritematoso sistA�mico. El grupo control estaba formado por 43 voluntarios sanos sin antecedentes de trombosis ni AL.

En varios de estos pacientes aparecen niveles extremadamente elevados de EPCR (Figura 9). Es A�sta la primera vez en la que se demuestra la existencia de autroanticuerpos dirigidos frente al EPCR. Llama la atenciA?n que las pacientes de sexo femenino con niveles mA?s altos de anti-EPCR tenA�an una historia de pA�rdidas fetales de repeticiA?n, un hallazgo frecuente en el sA�ndrome antifosfolA�pido. Este hecho llevA? a realizar un estudio de casos y controles para analizar el riesgo de muerte fetal asociado a la presencia de autoanticuerpos anti-EPCR.

Figura 9. Niveles de autoanticuerpos anti-EPCR de los isotipos IgM e IgG en pacientes con SAF y en sus respectivos controles. Los niveles de anti-EPCR se muestran en diagramas de cajas. Los puntos representan los pacientes cuyos niveles son extremadamente altos. AU es unidades de absorbancia a 492 nm.
2Autoanticuerpos anti-EPCR en mujeres con muerte fetal2
Se estudiA? un grupo de mujeres con un episodio de muerte fetal inexplicable. Las muestras de este grupo pertenecen a mujeres incluidas en el estudio NOHA (NA�mes Obstetricians and Haematologists Study) (28), cuyo objetivo es el estudio de embarazos anormales en el A?rea mediterrA?nea.

Se estudiaron 87 mujeres con edades comprendidas entre 19 y 31 aA�os (mediana: 27 aA�os) y que sufrieron un episodio de muerte fetal despuA�s de la dA�cima semana de gestaciA?n. Como criterios de exclusiA?n se consideraron antecedentes de trombosis o de pA�rdida fetal, retraso del crecimiento intrauterino o eclampsia, asA� como posibles causas que pudieran predisponer a la muerte fetal, como enfermedades crA?nicas infecciosas o diabetes mellitus de la gestante, y anomalA�as cromosA?micas o malformaciones macroscA?picas del feto. 58 mujeres de las 87 estudiadas padecieron el episodio durante su primer embarazo; 27 durante el segundo y ocho mujeres durante el tercero. El episodio de muerte fetal transcurriA? entre las semanas 10 y 22 en 75 mujeres y entre las semanas 22 y 36 en las doce restantes. La extracciA?n de las muestras se realizA? entre los seis y doce meses tras el episodio.

El grupo control estaba formado por 87 mujeres que habA�an llevado a tA�rmino al menos un embarazo y que acudieron a consulta para realizar un examen mA�dico general. Cada control se pareA? con una paciente de acuerdo con la edad, el nA?mero de embarazos y el tiempo transcurrido desde el A?ltimo embarazo. Todas ellas carecA�an de antecedentes trombA?ticos, enfermedades infecciosas crA?nicas y de todo lo considerado como criterio de exclusiA?n en el grupo de casos.Las muestras de sangre se recogieron durante el mismo periodo de tiempo que las del grupo de pacientes y en el mismo hospital.

Este estudio fue aprobado por el ComitA� A�tico del Hospital Universitario de NA�mes, y todas las participantes dieron su consentimiento para participar en A�l.
AdemA?s de los autoanticuerpos anti-EPCR, tambiA�n se incluyeron en el estudio los factores de riesgo clA?sicamente relacionados con la muerte fetal como el factor V Leiden, la mutaciA?n G20210A de la protrombina y los anticuerpos antifosfolA�pido (anticoagulante lA?pico y anticardiolipina) (tabla 1).

Se ha podido demostrar que los niveles elevados de anti-EPCR son un factor de riesgo independiente de muerte fetal: los niveles elevados de anti-EPCR de isotipo IgM aumentan aproximadamente veinte veces el riesgo de padecer una muerte fetal, independientemente de que presenten otros factores de riesgo para esta patologA�a (factor V Leiden, mutaciA?n G20210A de la protrombina, el anticoagulante lA?pico o los anticuerpos anticardiolipina) (tabla 2). La magnitud del riesgo de muerte fetal conferido por los autoanticuerpos anti-EPCR es muy grande lo que, junto con su elevada prevalencia (en nuestro estudio el 5% de la poblaciA?n sana presentA? niveles elevados frente a casi el 20% de las pacientes), da idea de la importancia clA�nica prA?ctica de estos autoanticuerpos.

No parece que en este estudio se sobrevalore el efecto de los anti-EPCR; antes al contrario, posiblemente se infravalora su efecto, ya que en la poblaciA?n estudiada se han excluido pacientes con muertes fetales repetidas y con antecedentes de trombosis, pacientes que, al menos teA?ricamente, cuentan con mayores probabilidades de tener factores de riesgo trombA?tico importantes.

Otro aspecto importante del riesgo de muerte fetal conferido por los anti-EPCR IgM es que el riesgo aumenta linealmente a medida que aumentan sus niveles, lo que habla a favor de que exista una relaciA?n causal entre la presencia de anti-EPCR y el evento clA�nico.

Sin embargo, cuando se analiza el efecto de los autoanticuerpos de isotipo IgG se encuentra que el efecto era mA?s dA�bil, y ademA?s independiente de la dosis. El hecho de que el isotipo IgM se asocie con la patologA�a mA?s que el IgG es, hasta cierto punto, sorprendente y de difA�cil explicaciA?n, si bien es cierto que es un hallazgo habitual en la patologA�a obstA�trica, en la que es mA?s frecuente detectar autoanticuerpos IgM que IgG. Una prueba se tiene en la propia poblaciA?n de este estudio, en la que este fenA?meno se repetA�a al analizar los anticuerpos anticardiolipina.

En este estudio tambiA�n se ve que los anticuerpos antifosfolA�pido, concretamente el anticoagulante lA?pico y los anticuerpos anticardiolipina IgM, se asociaban con un aumento de riesgo del muerte fetal (tabla 1), hecho extensamente descrito en la literatura. A pesar de ser A�sta una asociaciA?n clA�nica conocida desde hace mucho tiempo, no existe una explicaciA?n fisiopatolA?gica convincente que permita relacionar causalmente estos anticuerpos con las muertes fetales. Un hecho sorprendente, y que puede ayudar a dar una explicaciA?n, es que al considerar en el anA?lisis multivariante los autoanticuerpos anti-EPCR, el efecto de los anticuerpos antifosfolA�pido disminuye y pierde su significaciA?n.

Esto sugiere que dichos anticuerpos pueden verse limitados a ser meros marcadores de un proceso autoinmune, cuyos verdaderos protagonistas, aunque probablemente no A?nicos, sean los anticuerpos dirigidos contra el EPCR. Se debe tener en cuenta que el EPCR se localiza en la membrana del trofoblasto, justo en el lugar de interacciA?n entre la circulaciA?n materna y fetal.

Por lo tanto, los autoanticuerpos anti-EPCR se fijarA?n al EPCR en esta localizaciA?n, donde fA?cilmente podrA?n inducir efectos deletA�reos: por un lado podrA�an activar al complemento y asA� lesionar el trofoblasto y activar secundariamente la coagulaciA?n, lo cual conducirA�a a la trombosis de los vasos placentarios y la consiguiente muerte fetal. TambiA�n podrA�a ocurrir que los autoanticuerpos fijados al trofoblasto a travA�s del EPCR activen la citotoxicidad celular al interaccionar con receptores de la fracciA?n constante presente en la superficie de cA�lulas efectoras.

Por A?ltimo, si alguno de los autoanticuerpos inhibiera la uniA?n de la proteA�na C/PCA al receptor, al generar menos APC se producirA�a un estado de hipercoagulabilidad local, ademA?s de una propensiA?n a la apoptosis, lo cual nos llevarA�a a la trombosis de los vasos placentarios y a la muerte fetal.

Tabla 1. Riesgo de muerte fetal asociado con anticuerpos anti-EPCR, defectos trombofA�licos y anticuerpos antifosfolA�pido. Estudio univariante
*Niveles de anticuerpos anti-cardiolipina IgM e IgG mayores de 15 unidades MPL y GPL respectivamente, se consideraron positivos. Se realizA? el anA?lisis mediante regresiA?n logA�stica.

Tabla 2. Riesgo de muerte fetal asociado con niveles elevados de autoanticuerpos anti-EPCR. AnA?lisis multivariante

Se emplearon dos modelos en los que se realizA? regresiA?n logA�stica condicional: en el Modelo 1 se ajustA? por protrombina G20210A, AL, anticuerpos anticardiolipina y, en el caso de anticuerpos anti-EPCR isotipo IgM, por el isotipo IgG y viceversa; el Modelo 2 es como el Modelo 1 salvo que el ajuste se realizA? por el factor V Leiden en lugar de AL.

Autoanticuerpos anti-EPCR en mujeres con infarto agudo de miocardio (IAM)
DespuA�s de detectar la presencia de autoanticuerpos anti-EPCR en pacientes con SAF, los Dres. JosA� Hermida y RamA?n Montes decidieron estudiar el posible papel de estos autoanticuerpos en el IAM, pues esta patologA�a es una de las manifestaciones particularmente grave de este sA�ndrome.

Se realizA? el estudio en una poblaciA?n femenina porque es en este grupo donde los trastornos autoinmunes son mA?s frecuentes, y concretamente en las mujeres jA?venes (IAM antes de los 45 aA�os), ya que en esta poblaciA?n existe una prevalencia de factores de riesgo cardiovasculares particularmente baja comparada con los varones: el tabaquismo, la hipertensiA?n, la hipercolesterolemia, la obesidad o el sedentarismo son menos frecuentes entre las mujeres jA?venes con infarto prematuro que entre los varones jA?venes y, sin embargo, la prevalencia de antecedentes familiares de enfermedad cardiovascular juvenil es idA�ntica en mujeres y varones.

Estos datos epidemiolA?gicos hacen sospechar que existen factores de riesgo de infarto en las mujeres no relacionados con caracterA�sticas genA�ticas y familiares, y que serA�an de caracterA�sticas adquiridas.

Este grupo de pacientes estaba formado por 165 mujeres jA?venes que sobrevivieron a un primer episodio de IAM, con edades comprendidas entre los 22 y 48 aA�os (mediana: 39 aA�os). El diagnA?stico se confirmA? mediante arteriografA�a coronaria en el momento de la hospitalizaciA?n. Las muestras fueron recogidas durante el periodo de hospitalizaciA?n inmediatamente posterior al episodio de IAM. El grupo control estaba formado por 165 mujeres carentes de antecedentes trombA?ticos venosos o arteriales. Cada paciente se emparejA? con un control de edad similar (A� 3 aA�os).

De todas las mujeres incluidas en el estudio se disponA�a de la siguiente informaciA?n clA�nica: hipertensiA?n (se consideraban hipertensas tanto las mujeres diagnosticadas como tales, como las que tomaban medicaciA?n antihipertensiva); historia familiar de IAM precoz (antes de los 55 aA�os en los hombres y de los 65 aA�os en las mujeres); consumo de tabaco (se clasificaron como fumadoras las mujeres que hubieran fumado con regularidad durante los tres aA�os previos al IAM); diabetes mellitus (considerando diabA�ticas a las mujeres diagnosticadas de diabetes tipo I o II); menopausia; consumo de estrA?genos; niveles de HDL, colesterol y triglicA�ridos en suero.

En el grupo de pacientes se contemplA? tambiA�n el grado de estenosis coronaria: se considerA? que la lesiA?n coronaria era leve cuando la reducciA?n del diA?metro era inferior al 70% (al 50% en el caso de la coronaria principal izquierda), siendo severa si el estrechamiento era superior al 70% (al 50% en la coronaria principal izquierda); el resto de los casos, sin estenosis, se consideraron normales.

Se encontrA? que la presencia de autoanticuerpos anti-EPCR de isotipo IgA se asocia con un riesgo de IAM cinco veces mayor, independientemente de la presencia de los factores de riesgo cardiovascular tradicionales (tabla 3). La magnitud del riesgo de IAM asociado a los anti-EPCR es tan alta como puede ser el riesgo asociado al consumo de tabaco o a la hipertensiA?n. Estos datos invitan a pensar que estos autoanticuerpos puedan tener mucha importancia en la prA?ctica clA�nica. AdemA?s, siguiendo con los de isotipo IgA existe una relaciA?n directa y lineal entre sus niveles y el riesgo de IAM, lo cual habla a favor de una relaciA?n causal. En el caso del isotipo IgM el riesgo asociado, aun existiendo, es menor y sA?lo significativo cuando los niveles son muy altos.

Tabla 3. AsociaciA?n de autoanticuerpos anti-EPCR y de los factores de riesgo clA?sicos con IAM en mujeres jA?venes. AnA?lisis multivariante
Se realizA? un anA?lisis de regresiA?n logA�stica condicional ajustando por la hipertensiA?n, la historia familiar de infarto juvenil, el consumo de tabaco, la diabetes, la menopausia, el uso de estrA?genos, la relaciA?n HDL/colesterol y los niveles de triglicA�ridos.

Se puede pensar que los anti-EPCR podrA�an contribuir a la apariciA?n del evento agudo: independientemente de la existencia o no de una lesiA?n aterosclerA?tica, estos autoanticuerpos podrA�an inducir un incremento en la actividad coagulante sobre la superficie del vaso en el que se exprese el EPCR. A�ste se localiza en mayor medida en el endotelio de los vasos arteriales que en los venosos, y mA?s en los vasos de gran calibre.

Debido a esta peculiar distribuciA?n, los vasos especialmente vulnerables al efecto lesivo de los anti-EPCR serA�an los vasos arteriales, como las arterias coronarias, que expresan mucho EPCR en la superficie endotelial. En el caso de los autoanticuerpos de isotipo IgA, A�stos, fijados a la superficie endotelial, serA�an capaces de activar el complemento por la vA�a alternativa y por la vA�a de las manosas, para de este modo inducir una lesiA?n endotelial que expondrA�a factor tisular y fosfolA�pidos aniA?nicos, por lo que se activarA�a la coagulaciA?n; A�sta causarA�a la apariciA?n del trombo oclusivo, base fisiopatolA?gica del IAM.

Por otro lado, los complejos inmunes EPCR-anti-EPCR podrA�an asimismo inducir la captaciA?n de cA�lulas efectoras del sistema inmune, cuya acciA?n citotA?xica se sumarA�a a la ya citada del complemento, con consecuencias finales similares. Y tampoco se puede ignorar que, cuando los anti-EPCR sean capaces de impedir la uniA?n de la proteA�na C a su receptor, se verA? disminuida la capacidad de generaciA?n de PCA, lo cual conlleva una reducciA?n de la capacidad anticoagulante y antiapoptA?tica del vaso.

Estudios futuros y perspectivas

DespuA�s de todo lo comentado aquA�, se abren nuevas posibilidades e interrogantes que estudiar y resolver respecto al EPCR, sus autoanticuerpos y su relaciA?n en procesos trombA?ticos.

Por un lado, los resultados en SAF, muerte fetal e IAM animan a estudiar epidemiolA?gicamente el riesgo conferido por estos autoanticuerpos de padecer otras enfermedades con una base fisiopatolA?gica de trombosis. AsA�, en la Unidad de InvestigaciA?n en Trombosis y Hemostasia del CIMA, ya se han puesto en marcha estudios en trombosis venosa profunda, trombosis venosa portal, Ictus y accidentes isquA�micos transitorios y lupus eritematoso.

AdemA?s, la principal limitaciA?n de este estudio, derivada de las caracterA�sticas de su diseA�o retrospectivo, es que no se puede establecer inequA�vocamente la causalidad de la asociaciA?n observada entre los autoanticuerpos anti-EPCR y las patologA�as con procesos trombA?ticos (en el caso que nos ocupa, muerte fetal e IAM). No se puede descartar que la presencia de los anti-EPCR sea una consecuencia mA?s que su causa.

Para que sea posible establecer una relaciA?n causal, serA�a muy interesante realizar estudios de tipo prospectivo. Para intentar demostrar esta causalidad, tambiA�n se han puesto en marcha en la Unidad de InvestigaciA?n en Trombosis y Hemostasia del CIMA, por un lado, un estudio del efecto de los anticuerpos anti-EPCR en un modelo animal de trombosis y, por otro, un estudio de activaciA?n de complemento por los autoanticuerpos anti-EPCR, que ademA?s nos podrA�a orientar sobre la via mediante la cual los anticuerpos ejercen su efecto.

Si se llegara a demostrar su causalidad en las trombosis, se podrA�a pensar en estudiar posibles estrategias terapA�uticas y preventivas destinadas a conseguir la reducciA?n de niveles de autoanticuerpos anti-EPCR como medida para evitar procesos trombA?ticos. Estamos, por tanto, ante un nuevo agente causal de trombosis y, por el mismo motivo, ante una futura diana terapeA?tica. De ser asA�, la introducciA?n de un test sencillo, como A�ste ELISA, en la rutina de los laboratorios hospitalarios, constituirA�a una herramienta A?til que en A?ltimo tA�rmino podrA�a inducir a adoptar medidas profilA?cticas para prevenir el evento trombA?tico.

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