Uso del fragment screening para el descubrimiento de nuevos fA?rmacos

La gran dificultad que conlleva la identificaciA?n de un nuevo fA?rmaco se ve reflejada en la disminuciA?n que ha sufrido productividad global de la industria farmacA�utica en los A?ltimos aA�os. Una de las principales causas de esta dificultad es la gran cantidad de parA?metros que hay que considerar simultA?neamente. Se hace muy difA�cil conseguir un compuesto con suficiente potencia al mismo tiempo que un buen perfil farmacolA?gico.

Es indudable que como punto de partida, es importante disponer de compuestos que tengan una buena afinidad, y en ciertos casos selectividad, para la diana terapA�utica de interA�s. En este sentido, el fragment screening se ha establecido como un mA�todo alternativo y a la vez complementario del HTS (High-Throughput Screening). La idea principal de esta aproximaciA?n, es la de partir de molA�culas de un peso molecular mA?s pequeA�o a las usadas en HTS y evolucionarlas adecuadamente.

Si se visualiza el espacio quA�mico como un A?rbol (Figura 1), a medida que va aumentando la complejidad de las molA�culas, tambiA�n aumentan las ramas del A?rbol, de modo que en el espacio quA�mico correspondiente a las molA�culas a�?drug-likea�? el nA?mero de posibilidades (ramas) es enorme. De hecho, se estima que si se quisieran preparar unos pocos miligramos de cada uno de los posibles compuestos dentro de este espacio, esto equivaldrA�a a una masa superior a la del universo. EstA? claro que es imposible explorar todo el espacio quA�mico. En el caso del HTS, al trabajar en este espacio quA�mico enorme sA?lo se consigue cribar una pequeA�a porciA?n. Por otro lado, los hits que se generan a menudo tienen importantes partes de su estructura quA�mica que no estA?n involucradas en la interacciA?n con su receptor, dificultando asA� su posterior optimizaciA?n.

Una alternativa a esta aproximaciA?n es la de trabajar en regiones donde el nA?mero de ramas es menor, es decir zonas donde las molA�culas son menos complejas y que corresponden al espacio quA�mico de los fragmentos. Los fragmentos, al ser mA?s pequeA�os es mA?s probable que puedan interaccionar con alguna de las cavidades o subcavides que hay en el centro activo de una diana terapA�utica. Esto hace que el porcentaje de hits que se encuentran en una campaA�a de fragment screening es notablemente mA?s alto que en el caso del HTS.

Unos parA?metros que en los A?ltimos aA�os se han establecido como una buena mA�trica para evaluar el potencial de un hit de partida son los relacionados con la Eficiencia de UniA?n (ligand eficiency)(1). Aunque existen varios parA?metros en general la eficiencia de uniA?n consiste en la normalizaciA?n de la potencia respecto el nA?mero de A?tomos de la molA�cula. En el caso que se considere el cociente entre la energA�a libre de Gibbs y el nA?mero de A?tomos no hidrA?geno, se estima que un compuesto tiene buen potencial de optimizaciA?n si el valor es superior a 0,3. En el caso del fragment screening, auque los hits inicialmente son poco potentes, una gran parte de la molA�cula participa en la interacciA?n con la diana de modo que los puntos de partida presentan muy buenas eficiencias de uniA?n.

Finalmente, a parte de la mayor posibilidad de encontrar un espacio quA�mico libre de patentes, otra gran ventaja del uso de fragmentos como punto de partida es que se parte de molA�culas con una complejidad quA�mica menor por lo que es mA?s sencillo optimizar estos puntos de partida.

Una vez identificados los hits de partida, existen distintas estrategias de optimizaciA?n (Figura 2)(2). En los primeros trabajos de fragment screening, se planteaba bA?sicamente la idea de identificar dos fragmentos que se unan en subcavidades contiguas y unirlos mediante un linker (linking)(3). Hoy en dA�a, esta aproximaciA?n se ha visto que es bA?stante difA�cil y se usan estrategias mA?s eficientes como la fusiA?n de las partes que tengan en comA?n dos fragment hits (merging) y la optimizaciA?n del hit de partida hacia las regiones del sitio de uniA?n que queden por cubrir (growing). En todo caso, el resultado final de este proceso es la identificaciA?n de una serie de estructuras quA�micas (scaffolds) que serA?n el punto de partida para el proceso posterior de optimizaciA?n.

Es en este proceso de optimizaciA?n donde el fragment screening requiere mayor experiencia ya que al partir de molA�culas pequeA�as las posibilidades de variaciones quA�micas son muy grandes. En el caso que se disponga de la estructura tridimensional se puede acotar mucho el campo de optimizaciA?n, pero de todos modos son necesarias estrategias que permitan llevar a cabo este proceso de forma sistemA?tica.

Recientemente, se han producido grandes avances en un conjunto de tA�cnicas biofA�sicas que permiten obtener una gran cantidad de informaciA?n para comprender el proceso de interacciA?n entre los potenciales fA?rmacos y las dianas terapA�uticas. Gracias a estos avances hoy en dA�a es posible obtener esta informaciA?n para un mayor nA?mero de compuestos en unos tiempos mA?s reducidos y con un menor consumo de material. En Crystax Pharmaceuticals, se han integrado las herramientas del diseA�o de fA?rmacos basados en la estructura (Structure-based drug design) con este conjunto de herramientas biofA�sicas de A?ltima generaciA?n y la estrategia del fragment screening para desarrollar nuevos fA?rmacos bajo la plataforma integrada denominada Biophysics-based Drug Discovery (B2D2a�?). Toda la informaciA?n generada mediante estas tA�cnicas biofA�sicas se combina con la informaciA?n estructural con otros criterios mA?s habituales como la caracterizaciA?n de las propiedades ADMETox, los ensayos de actividad, ensayos celulares y criterios de quA�mica mA�dia y propiedad intelectual.

En cuanto a poner en prA?ctica el fragment screening, hay que tener en cuenta los siguientes aspectos:

SelecciA?n de la librerA�a

En el caso que se quiera tener una librerA�a que permita su aplicaciA?n en todo tipo de dianas terapA�uticas, es importante hacer una selecciA?n de los fragmentos basada en maximizar la diversidad quA�mica.

En Crystax, el proceso de selecciA?n de fragmentos es uno de los aspectos mA?s trabajados, para ello se han realizado diversas rondas de selecciA?n en las cuales se ha refinando el proceso de filtraje.

En una primera etapa, se genera una base de datos con unos 3 millones de compuestos comerciales disponibles en las distintas casas comerciales. En el primer filtraje se consideran las propiedades moleculares del compuesto para eliminar todos aquellos compuestos que estA�n fuera del espacio quA�mico de los fragmentos (se tiene en cuenta desde el tamaA�o de la molA�cula hasta el nA?mero de anillos, heteroA?tomos, enlaces no rotatorios, aceptores-dadores de enlaces de hidrA?geno, etc.). Los compuestos que superan este primer filtro, se evalA?an de nuevo para eliminar todos aquellos que contengan grupos funcionales inestables o que pudiesen reaccionar en las condiciones de los ensayos. Una vez aplicados estos dos filtros, quedan unos 80.000 compuestos que se pueden considerar como aptos para ser usados en una campaA�a de fragment screening.

De cara a maximizar la eficiencia del proceso, en Crystax, se aplica un proceso de agrupaciA?n de los 80.000 compuestos (i.e. agrupaciA?n en famA�lias de compuestos similares) y se selecciona un representante de cada una de las principales familias.

El proceso de selecciA?n se ha basado en tener la mayor diversidad posible y la misma librerA�a se puede usar para identificar hits para dianas terapA�uticas de todo tipo. De hecho, esta la librerA�a de fragmentos explora mejor el espacio quA�mico disponible que 1millA?n de los compuestos usados en un HTS clA?sico.

Por otro lado, mediante la combinaciA?n de la gran cantidad de informaciA?n que se genera, se pueden identificar estructuras quA�micas novedosas, es decir patentables, para la mayorA�a de las dianas estudiadas.

Control de calidad

Teniendo en cuenta que las tA�cnicas de screening usadas en esta aproximaciA?n en general utilizan elevadas concentraciones de compuesto y a menudo tambiA�n utilizan mezclas de compuestos, es necesario llevar a cabo un exhaustivo control de calidad.

AsA� una vez seleccionados los fragmentos, mediante RMN se evalA?a la pureza, estabilidad y solubilidad de cada compuesto individual. Posteriormente los compuestos que superan el primer control de calidad se agrupan en mezclas asegurando la mA�nima superposiciA?n de seA�ales de sus espectros de protA?n. Finalmente, estas mezclas se evalA?an de nuevo mediante RMN para asegurar que todos los compuestos son solubles y se mantienen estables en estas condiciones. Hoy en dA�a en Crystax, se dispone de una librerA�a de 1000 compuestos que se usan rutinariamente en los screenings.

Todo este largo y tedioso proceso es de vital importancia para asegurar la calidad de los screenings que se puedan llevar a cabo posteriormente. AdemA?s tambiA�n es importante llevar un control rutinario del estado de la librerA�a para eliminar los compuestos que generen problemas.

ObtenciA?n de la diana terapA�utica

Las tA�cnicas usadas en general requieren elevadas cantidades de proteA�na (>10mg), por lo que es esencial poder disponer de la diana terapA�utica en suficientes cantidades y con gran calidad. Con este fin, Crystax en cada proyecto explora distintos sistemas de expresiA?n, principalmente E.Coli y cA�lulas de insecto, asA� como distintas variantes de la diana de interA�s.

Screening primario

A pesar de todas sus ventajas, el hecho de usar fragmentos tiene la dificultad que al ser poco potentes es difA�cil identificar los fragmentos que se unen con la diana de interA�s mediante ensayos bioquA�micos estA?ndar, por lo que es necesario disponer de tA�cnicas con una mayor sensibilidad. Es en esta primera etapa de identificaciA?n de fragment hits donde las tA�cnicas biofA�sicas juegan un papel determinante en la aproximaciA?n usada en Crystax.

Para llevar a cabo el screening inicial de la librerA�a de fragmentos, en Crystax se usan tA�cnicas de resonancia magnA�tica nuclear basadas en la observaciA?n de los seA�ales de los fragmentos. Estas tA�cnicas permiten identificar con gran sensibilidad los compuestos que se unen a la diana terapA�utica con un consumo mA�nimo de proteA�na y de forma muy rA?pida. En una de estas tA�cnicas, en el espectro de protA?n sA?lo se observan las seA�ales de los compuestos que interaccionan con la diana, permitiendo asA� identificar los hits dentro de una mezcla de compuestos sin necesidad de realizar ensayos adicionales. (Figura 3).

A partir del screening mediante resonancia magnA�tica nuclear, se obtiene el listado de fragmentos que interaccionan con la proteA�na de interA�s. Adicionalmente, esta selecciA?n de fragmentos se puede refinar mediante el uso de experimentos de competiciA?n con inhibidores conocidos y/o el uso de proteA�nas con mutaciones que impidan la uniA?n a sitios especA�ficos de esta. Habitualmente, el porcentaje de hits de este primer screening se encuentra entre el 3 y el 10%, de modo que se dispone de un primer listado de al menos 30 fragmentos capaces de interaccionar con la proteA�na de interA�s. Porcentajes menores, a menudo son indicativos de que la proteA�na no contiene ninguna cavidad apta para la uniA?n de molA�culas pequeA�as y que por tanto, es poco a�?drogablea�?.

Existen otras tA�cnicas alternativas que se pueden usar como screening primario, como la resonancia magnA�tica nuclear basada en los seA�ales de proteA�na, denominada SAR-by-NMR. Esta tA�cnica tiene la desventaja que requiere mucha mA?s cantidad de proteA�na marcada isotA?picamente. TambiA�n se podrA�a usar la resonancia de plasmA?n superficial pero requiere inmovilizar la proteA�na en un soporte sA?lido. Finalmente, se podrA�a usar directamente la cristalografA�a de rayos X pero requiere analizar varios centenares de cristales en vez de varias decenas, con el importante consume de tiempo y proteA�na que conlleva.

ResoluciA?n de la estructura tridimensional del complejo fragmento-diana

Gracias a la experiencia de los fundadores de la compaA�A�a uno de los puntales de Crystax es el uso de la cristalografA�a de biomolA�culas. En el caso del fragment screening, la posibilidad de tener la estructura 3D del complejo fragmento-proteA�na aumenta enormemente las posibilidades de optimizar eficientemente el fragmento inicial, ya que acota las regiones de la molA�cula a optimizar.

De cara a poder llevar a cabo el estudio de algunas decenas de fragmentos, a menudo no es suficiente con disponer de cristales de la proteA�na de interA�s, si no que es necesario desarrollar un sistema que permita aplicar una aproximaciA?n tipo High-throughput. En este sentido, Crystax lleva a cabo una exploraciA?n sistemA?tica de mA?s de 1000 condiciones cristalogrA?ficas en busca del sistema que sea suficientemente robusto (Figura 4).

Idealmente, se buscan condiciones que permitan obtener cristales de la proteA�na que no contengan ningA?n ligando en el sitio activo, asA� se puede estudiar cada uno de los fragmentos identificados mediante RMN a travA�s de la tA�cnica del a�?soakinga�?. Esta tA�cnica consiste en poner el cristal en contacto con una soluciA?n del fragmento y posteriormente llevar a cabo la resoluciA?n de la estructura. En algunos casos esta tA�cnica no se puede utilizar debido al empaquetamiento del cristal o por los cambios conformacionales que se producen cuando la proteA�na interacciona con el fragmento. Entonces es necesario llevar a cabo estudios de co-cristalizaciA?n con cada uno de los fragmentos.

En general, con alrededor del 40-50 % de los fragmentos identificados mediante RMN se obtiene una estructura cristalogrA?fica. El aparentemente elevado porcentaje de compuestos para los cuales no se obtiene una estructura, se debe principalmente a que las condiciones de cristalizaciA?n (pH, concentraciA?n de precipitante, etc.) en algunos casos pueden afectar a la uniA?n con la proteA�na.

La etapa cristalogrA?fica, al permitir visualizar en 3D la uniA?n de la diana con los ligandos aA�ade una gran cantidad de informaciA?n estructural (Figura 5). Esta no se limita a nuevas estructuras quA�mica interesantes, si no tambiA�n informaciA?n de las aguas estructurales de la proteA�na, la flexibilidad de los distintos residuos y los principales puntos de reconocimiento de molA�culas (hot-spots). Toda esta informaciA?n es esencial para definir cuales son los fragmentos mA?s interesantes y ver cual puede ser el camino mA?s A?ptimo para su optimizaciA?n.

AplicaciA?n del fragment screening en Crystax

Crystax usa el fragment screening y la plataforma B2D2a�? tanto para el desarrollo de sus propios proyectos de investigaciA?n como para llevar a cabo colaboraciones con otras empresas del sector. Des del inicio de le etapa de fragment screening en 2005, en Crystax se han evaluado mA?s de 10 dianas relacionadas con distintas A?reas terpA�uticas, hecho que ha permitido generar un sA?lida experiencia. Hoy en dA�a Crystax es la A?nica empresa espaA�ola con el know-how necesario para llevar a cabo esta aproximaciA?n de forma sistemA?tica.

Por otra lado, gracias a la informaciA?n generada mediante el conjunto de la plataforma B2D2a�? Crystax ha sido capaz de identificar nuevas series de inhibidores para distintos proyectos de investigaciA?n internos, que han colocado la compaA�A�a en una situaciA?n muy competitiva en dianas muy relevantes en el campo de la investigaciA?n oncolA?gica.

Fruto de estas innovaciones tecnolA?gicas, durante el aA�o 2007 Crystax recibiA? el premio de la primera convocatoria Emprendedor XXI en CataluA�a a la empresa con mayor potencial de crecimiento y el premio ENISA de innovaciA?n en el apartado de Ciencias de la vida.

Conclusiones

El fragment screening es una estrategia que cada dA�a va ganando mA?s aceptaciA?n en la industria farmacA�utica gracias a los buenos resultados que va generando(4). Tanto es asA�, que durante los prA?ximos aA�os veremos como se afianza en la mayorA�a de empresas como herramienta complementaria a otras aproximaciones y la identificaciA?n de fragment hits se convertirA? en un proceso relativamente estA?ndar.

En este sentido, el prA?ximo reto estA? en como usar toda la informaciA?n generada y identificar las estrategias y criterios que permitan optimizar los fragmentos de partida de la forma mA?s eficiente y sistemA?tica posible. En este sentido, la aproximaciA?n utilizada en Crystax busca establecer las bases para poder llevar a cabo este proceso mediante la integraciA?n de distintas A?reas como son la biologA�a estructural, la biofA�sica, la quA�mica mA�dica y las propiedades ADMEtox.

Esta serA? la clave futura en el uso del fragment screening, elegir el mejor camino en le inmenso espacio quA�mico para evolucionar los fragmentos. BM

1. Hopkins, A.L., Groom, C.R and Alex, A. (2004) Ligand efficiency: a useful metric for lead selection Drug Discovery Today 9, 430-.431.

2. Carr, R and Jhoti, H. (2002) Structure-based screening of low-affinity compounds Drug Discovery Today 7, 522-527.

3. Shuker, S.B., Hajduk, P.J., Meadows, R.P. and Fesik, S.W. (1996) Discovering High-Affinity Ligands for Proteins: SAR by NMR Science 274, 1531-1534.

4. Alex, A.A. and Flocco, M.M. (2007) Fragment-based drug discovery: what has it achieved so far? Curr.Top.Med.Chem. 7, 1544- 1567.