Equipos para cultivo de cA�lulas animales

Establecer las condiciones de un proceso productivo basado en cA�lulas de mamA�fero requiere completar un nA?mero de etapas muy elevado: selecciA?n del modelo celular, ingenierA�a genA�tica para expresar la molA�cula de interA�s, selecciA?n clonal, definiciA?n del medio y condiciones de cultivo, selecciA?n de la estrategia de cultivo, purificaciA?n y expediciA?n final, controlando calidad y actividad de producto. Todos estos requerimientos han de ser definidos y optimizados con una elevada precisiA?n para poderlos transferir con A�xito a escala de producciA?n, que se verA? sujeta normalmente a estrictas normativas GMP, y cuyas condiciones serA?n difA�cilmente modificables una vez los procesos han sido establecidos y validados por las agencias reguladoras pertinentes. Otro elemento a tener en cuenta en el desarrollo de los bioprocesos es la elevada importancia del factor tiempo, que las empresas intentan minimizar para facilitar los avances hacia el lanzamiento de nuevos productos.

En las distintas etapas del desarrollo del bioproceso se utilizan diferentes sistemas de cultivo, desde placas con volA?menes del orden de los microlitros hasta reactores de unas decenas o centenares de litros, con los cuales se realizan tareas de escalado.

A menudo, los resultados obtenidos en sistemas de pequeA�a escala no son totalmente reproducibles a escalas superiores. De la misma forma, los sistemas de pocos microlitros de volumen no permiten reproducir, en condiciones homogA�neas, situaciones de cultivo que se quieran investigar o caracterizar. AsA� pues, hay una serie de aspectos a los que se tiene que prestar una especial atenciA?n para mantener al mA?ximo la reproducibilidad entre las diferentes escalas de cultivo. El estrA�s por agitaciA?n es uno de los parA?metros que pueden aparecer, puesto que en las etapas de selecciA?n de los clones generados es habitual centrarse en la producciA?n de cada uno de ellos y no tener en cuenta la sensibilidad al estrA�s al que los cultivos se verA?n sometidos al pasar a sistemas agitados. Este hecho puede implicar seleccionar clones que posteriormente no serA?n vA?lidos para los procesos de producciA?n a escala, con las pA�rdidas de tiempo y dinero que esto tendrA? asociado. Otro de los aspectos que puede implicar no reproducibilidad de los resultados es la homogeneidad, puesto que sistemas no agitados pueden llevar a acumulaciones de cA�lulas y gradientes en las concentraciones de nutrientes que pueden producir resultados irreproducibles. Finalmente, un A?ltimo aspecto a destacar es la importancia de la monitorizaciA?n de los cultivos, puesto que disponer de mA?s informaciA?n sobre los cultivos permitirA? detectar limitaciones o posibles problemA?ticas. En concreto, se considera de especial interA�s conocer la evoluciA?n de las principales variables del cultivo (pH, pO2), asA� como el crecimiento y actividad metabA?lica. Por ejemplo, pueden existir limitaciones de oxA�geno o valores de pH que lleven a productividades difA�cilmente reproducibles si no se conocen los parA?metros que las generan.

En la actualidad una parte importante del desarrollo de los bioprocesos se realiza en placas de pequeA�o volumen, trabajando con incubadores, y dados los riesgos de reproducibilidad acabados de comentar, la industria de los biorreactores ha desarrollado tecnologA�as para mejorar estos procesos. BA?sicamente la opciA?n que se ha seguido estA? basada en la miniaturizaciA?n de biorreactores de escala de laboratorio (estA?ndar de uso en la mayorA�a de laboratorios para desarrollar procesos basados en cA�lulas de mamA�fero) de tal manera que se mantengan las prestaciones principales, como son la agitaciA?n y el seguimiento de las variables clave de cultivo (pH, pO2), permitiendo la realizaciA?n de mA?ltiples cultivos simultA?neos. Entre los distintos equipos que han sido desarrollados durante los A?ltimos aA�os (Betts and Baganz, 2006) se encuentra el de Hexascreen Culture Technologies, una plataforma con seis minibiorreactores, de un volumen entre 10-15 ml, que a parte de seguir las principales variables de cultivo (pH, pO2) tambiA�n monitoriza automA?ticamente crecimiento (absorbancia) y metabolismo (indirectamente a partir de acidificaciA?n/consumo de oxA�geno).

El sistema HEXASCREENA�, ha sido diseA�ado intentando superar la complejidad de uso que se encuentra habitualmente en los biorreactores, y que implican procesos laboriosos de preparaciA?n, esterilizaciA?n y calibraciA?n previos al inicio de los cultivos, requeriendo personal altamente cualificado. Con este fin, el diseA�o del sistema HEXASCREENA� se ha fijado en la facilidad de trabajo con placas multipozo y contempla:

a�� Placas de plA?stico de un solo uso, que contienen los seis minibiorreactores, y que de forma anA?loga a una placa multipozo, se suministra de forma estA�ril y el usuario solamente tiene que inocular los cultivos antes de situar la placa en la estaciA?n de trabajo.

a�� La estaciA?n de trabajo dA?nde se sitA?an las placas de plA?stico, que suministra la temperatura y los gases necesarios para que se produzca el crecimiento de los cultivos, e incorpora los sistemas de agitaciA?n y sondas no-invasivas, cuyos datos son transferidos automA?ticamente a un ordenador de control.

Algunos de los principales usos de los sistemas de mA?ltiples minibiorreactores son la optimizaciA?n de medios de cultivo, la comparaciA?n entre clones, el estudio de las condiciones de cultivo, y la realizaciA?n de pruebas de toxicidad. TambiA�n es interesante la realizaciA?n de estudios de a�?scale-downa�?, en los que se reproduzcan distintas condiciones que puedan producirse en un biorreactor industrial y se analicen sus efectos.

A continuaciA?n se presenta un ejemplo de aplicaciA?n del sistema HEXASCREENA� con una lA�nea de hibridoma, comprobando inicialmente la reproducibilidad de los cultivos. Una vez contrastada la consistencia del sistema de minibioreactores para realizar cultivos y la precisiA?n de su seguimiento, se presenta un ejemplo sobre la capacidad de reducir la concentraciA?n de suero en el medio de cultivo, puesto que aunque el producto producido era para diagnA?stico, la presencia de suero producA�a problemas en los pasos de purificaciA?n y su concentraciA?n querA�a reducirse.

Para conocer la reproducibilidad del equipo y la precisiA?n en el seguimiento de los cultivos, se presenta un primer experimento con los seis reactores creciendo simultA?neamente, todos con el mismo inA?culo (2×105 cA?lA�l/ml de una determinada lA�nea de hibridoma) y medio de cultivo (DMEM 10% FCS). En la Figura 3 se observa como las medidas de absorbancia y pH son altamente reproducibles entre los distintos minibioreactores. TambiA�n se puede apreciar el buen comportamiento de las medidas del consumo de oxA�geno (Oxygen Uptake Rate, OUR), que de hecho consiste en una medida indirecta obtenida a partir los datos de concentraciA?n de oxA�geno disuelto. Un elemento interesante que aporta el sistema de cultivo es que aprovechando sus capacidades de monitorizaciA?n se puede discutir y aportar hipA?tesis sobre el comportamiento observado en los cultivos. AsA�, en el caso que se presenta se puede observar que aproximadamente a las 46h hay un punto de inflexiA?n en el crecimiento, asA� como un cambio de tendencia metabA?lico (en la acidificaciA?n y consumo de oxA�geno) (Figuras 2 y 3). El anA?lisis off-line de estos datos permitiA? comprobar que el limitante del medio de cultivo era la glutamina, que se agotaba a las 46 h de cultivo (Figura 4).

El segundo ejemplo de cultivo que se presenta en este artA�culo es un experimento para evaluar el efecto de una reducciA?n de la concentraciA?n de suero en el comportamiento de esta lA�nea celular. La reducciA?n o supresiA?n de este componente del medio es altamente interesante en distintos casos, puesto que muchos de los sueros existentes en el mercado no son utilizables para la producciA?n de productos para terapia y en los casos en que pueden ser utilizados sin inconvenientes regulatorios, el suero emperora significativamente los rendimientos de purificaciA?n. En el experimento los resultados del cual se muestran en la figura 4, se realizaron cultivos a distintas concentraciones de suero, desde el 10% (V/V), que era la concentraciA?n de partida, hasta el 0% (V/V). En la figura se observa como una eliminaciA?n del suero en el medio implica una parada prA?cticamente total de la actividad metabA?lica, y analizando el estado de las cA�lulas fuera de lA�nea se puede observar como han iniciado el proceso de muerte celular por apoptosis. Por otro lado, una reducciA?n al 1% permite un cierto crecimiento inicial, aunque la falta de factores de crecimiento hace que pronto las cA�lulas dejen de dividirse, si bien siguen vivas y con una cierta actividad metabA?lica.

AsA� pues, el resultado de esta prueba mostrA? que el sistema de minibioreactores presentado permite distinguir las diferencias de crecimiento y metabolismo existentes, y que esta lA�nea celular no toleraba una reducciA?n tan drA?stica de la concentraciA?n de suero, de manera que tuvieron que abrirse otras vA�as como seguir procesos de adaptaciA?n progresiva a la reducciA?n de suero, o el paso a medios definidos sin suero (Figura 5). BM

Bibliografia

F. WA?rm (2004). Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nature biotechnology, 22, 11.

S.S. Ozturk and W.-S. Hu (2006). Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cellular Therapies. Taylor & Francis. New York.

J.I. Betts, and F. Baganz (2006). Miniature bioreactors: current practices and future opportunities. Microbial Cell factories 2006, 5, 21.