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Sistemas de expresión de proteínas en Escherichia Coli para la producción de biofármacos. Alternativas y criterios de selección

Escrito por Redacción el 5 octubre, 2010 en Reportajes
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Introducción

De manera análoga a lo que ocurre en el mercado de los fármacos clásicos con el desarrollo de los fármacos genéricos, cuando los biofármacos de marca pierden su protección industrial debido a la finalización del plazo de protección por patente, aparecen en el mercado fármacos similares para la misma indicación terapéutica, pero que debido al gran impacto que la modificación de los métodos de producción pueden tener en la actividad del fármaco, no se denominan genéricos, sino biosimilares. Estos biofármacos están registrados conforme a lo establecido por las agencias reguladoras pero tienen un tratamiento particular. Los proveedores del mercado de los biosimilares, en crecimiento y expansión, necesitan disponer de sistemas biológicos de producción robustos y muy productivos, para competir en coste con los biofármacos originales.

Los biofármacos son principalmente proteínas recombinantes. Estas proteínas se obtienen a partir de organismos vivos, los organismos hospedadores, en los que se ha introducido material genético procedente de otro organismo mediante técnicas de ADN recombinante, de tal manera que el organismo hospedador o huésped, emplea su maquinaria biológica para producir la proteína cuya secuencia está codificada en el ADN introducido artificialmente. Tradicionalmente, la producción de proteínas consistía en el aislamiento y mejora de las propiedades biológicas de proteínas específicas a partir de diversas fuentes naturales, como por ejemplo animales, plantas o microorganismos, para su posterior utilización en diversas aplicaciones, terapéuticas o de otra índole. Gracias al avance en las técnicas de ADN recombinante y al desarrollo de sistemas de expresión de proteínas recombinantes ha sido posible producir grandes cantidades de proteínas, muchas de las cuales se encuentran en concentraciones muy bajas en su ambiente natural.

La expresión de proteínas recombinantes se ha realizado tanto en células procariotas como en células eucariotas, siendo las primeras las más conocidas y estudiadas. Las células eucariotas más utilizadas a nivel industrial son las levaduras (Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae), los hongos filamentosos (Aspergillus niger, Aspergillus oryzae), las células de insecto (Drosophila S2) y las células de mamífero (CHO, HEK, HELA). Las levaduras son fácilmente cultivables en medios de cultivo económicos y las proteínas que producen presentan un elevado grado de homología respecto a los organismos superiores. Sin embargo, las glicoproteínas producidas en este huésped disponen de un patrón de glicosilación diferente al humano, aunque se han realizado avances en la modificación de los patrones de glicosilación de levaduras para conseguir que produzcan proteínas recombinantes terapéuticas con estructuras glicosiladas similares a las humanas(1,2). Las células de insecto son útiles para el procesamiento de proteínas complejas, especialmente glicoproteínas, sin embargo, su patrón de glicosilación difiere respecto a las células de mamífero(3). Finalmente, las células de mamífero tienen la ventaja de que producen correctamente glicoproteínas humanas bien de forma transitoria o bien de forma estable, pero el coste de la producción es elevado en comparación con los sistemas procariotas debido al coste de materiales, a la densidad celular que pueden alcanzar los cultivos y al tiempo de generación celular, ya que una bacteria se divide más de cincuenta veces en el tiempo en el que una célula de mamífero se divide una vez.

Dentro de los sistemas procariotas, uno de los modelos de expresión más utilizados ha sido Escherichia coli. El éxito de Escherichia coli se basa principalmente en; i) la facilidad de manipulación del DNA; ii) el elevado número de mutantes y vectores de expresión disponibles; iii) el amplio conocimiento de la fisiología de la célula, que permite alcanzar densidades celulares elevadas con un medio de cultivo económico, y; iv) el conocimiento del efecto de la sobreexpresión de proteínas sobre la bacteria. Sin embargo, Escherichia coli presenta ciertos inconvenientes en la síntesis de proteínas recombinantes: i) no lleva a cabo procesamientos post-transduccionales propios de células eucariotas, como es el caso de la glicosilación o fosforilación, lo cual afecta a la estructura, estabilidad, solubilidad y actividad biológica de la proteína producida; ii) carece de chaperonas (proteínas de plegamiento) adecuadas para permitir un plegamiento correcto de las proteínas recombinantes; iii) y no forma puentes disulfuro en el citoplasma, salvo en ciertas cepas mutantes(4).

Para producir proteínas recombinantes en Escherichia coli es necesario que las células dispongan de un mecanismo capaz de procesar la información genética que codifica para la proteína de interés, bien sea industrial o farmacéutico, y permitir así producir grandes cantidades de dicha proteína. El conjunto de organismo hospedador y elementos de procesamiento de la expresión genética para la síntesis proteica recibe el nombre de sistema de expresión.

Sistemas de expresión en Escherichia coli

En general, un sistema de expresión consiste en un conjunto de elementos genéticos configurados de manera óptima para el control de la transcripción y traducción de las secuencias a expresar(5,6). El sistema de expresión en Escherichia coli está constituido por dos componentes: una bacteria huésped y un vector de expresión que posee los elementos génicos necesarios para realizar los procesos de transcripción y traducción en dicha bacteria. Respecto al vector de expresión es preciso tener en cuenta varios criterios con el fin de obtener una expresión eficiente: el origen de replicación, que influye en el número máximo de copias del vector de expresión por cada célula, las características de las secuencias de inicio y final de la transcripción, entre las que se incluyen los promotores y terminadores, las señales de comienzo de la traducción, como son el codón de inicio de la traducción y los sitios de unión al ribosoma, la localización subcelular de la proteína que se va a expresar (citoplasma o periplasma) y el control de la segregación plasmídica. En la segregación plasmídica es de gran importancia el mecanismo de retención del vector en la célula. El mecanismo clásico para evitar el inconveniente de la segregación es la coexpresión en el vector de un gen codificante para la resistencia a un marcador de selección, generalmente un antibiótico, de manera que únicamente la células que posean en su interior el vector serán capaces de propagarse en un medio de cultivo que contenga el marcador de selección. Otro mecanismo que previene la pérdida del vector y evita el uso de antibióticos es la inclusión en el vector de regiones cromosómicas que complementen la auxotrofía de una determinada cepa bacteriana(7), es decir, únicamente las células que contengan el vector serán capaces de crecer en un medio de cultivo que carezca del elemento para el que la cepa es auxótrofa.

La cepa de Escherichia coli más utilizada en los sistemas de expresión es la BL21, debido a que es defectiva en las proteasas OmpT y Lon, involucradas en la degradación de proteínas. En función del sistema de expresión empleado, la cepa puede contener el módulo regulador de la expresión integrado en el cromosoma. En el caso concreto de los sistemas de expresión pET (Novagen) y pRSET (Invitrogen) la cepa de expresión contiene el ADN del bacteriófago DE3 integrado en el cromosoma. Este bateriófago contiene a su vez el gen codificante de la T7 RNA polimerasa regulado por el promotor lacUV5 cuya actividad se induce por medio de la adición del inductor IPTG (Isopropyl-?-D-thiogalactopyranoside). En este sistema, el vector de expresión pET utilizado para la expresión de la secuencia codificante de la proteína de interés, incorpora una región promotora reconocida por la T7 RNA polimerasa, de manera que tras la adición del IPTG, la T7 RNA polimerasa expresada desde el cromosoma bacteriano induce la expresión de la proteína a partir del vector. En el caso de los sistemas pGEX (GE Healthcare), pQE (QIAGEN), pTrc (Invitrogen), pBAD (Invitrogen) la expresión de las proteínas recombinantes no está supeditada a la presencia de un módulo regulador integrado en el cromosoma de la bacteria. En estos casos, los elementos reguladores del promotor para la expresión de proteínas recombinantes están incluidos en el vector, por lo que el mismo vector puede emplearse en combinación con diferentes cepas.

En la Tabla 1 se resumen los sistemas de expresión comerciales comúnmente utilizados para la expresión de proteínas recombinantes en Escherichia coli.

En general, la producción de proteínas recombinantes para investigación básica e industrias farmacéuticas se ha basado en la amplificación génica mediante sistemas de expresión con promotores fuertes regulados por represores que controlan el nivel basal de expresión. Sin embargo, recientemente se ha desarrollado un sistema de expresión novedoso y alternativo basado en un circuito de expresión en cascada que no requiere el consumo de energía metabólica para reprimir la expresión basal de la proteína recombinante y que se activa tras la adición del inductor salicilato y derivados del benzoato, mucho más económicos que el tradicionalmente utilizado IPTG, empleado como inductor en el sistema pET.

Sistema en Cascada o Circuito en cascada de expresión

El sistema de expresión en cascada consiste en un circuito de expresión génica constituido por un módulo de regulación localizado en el cromosoma de la bacteria huésped y un módulo de expresión que puede estar contenido en un plásmido extracromosomal o bien integrado en el cromosoma de la bacteria.

El módulo de expresión insertado en el cromosoma de la bacteria está formado por el gen codificante para la proteína NahR, el promotor diana de NahR, Psal, y el gen codificante de la proteína XylS bajo la regulación del promotor Psal. La proteína NahR es un activador transcripcional positivo codificado por el gen nahR, necesario para la activación de dos operones involucrados en el catabolismo de naftaleno en Pseudomonas putida(8,9). La proteína NahR, activada por el inductor natural salicilato, promueve la expresión de genes controlados por el promotor diana Psal(10). El otro miembro del módulo de regulación es la proteína XylS que pertenece a la familia AraC de reguladores transcripcionales involucrada en el control de la expresión de genes relacionados con la virulencia, estrés y metabolismo en Pseudomonas putida. XylS es un activador transcripcional de Pm, un promotor que controla la expresión de los componentes de la vía de catabolismo del benzoato y alquilbenzoato localizados en el plásmido pTOL de Pseudomonas putida(11).

Por otra parte, el módulo de expresión está formado por el promotor Pm regulado por el factor de transcripción XylS, y el gen de interés codificante para la proteína a expresar. Este módulo de expresión se puede disponer en dos configuraciones: bien formar parte de un plásmido autoreplicativo o bien como integración cromosómica en la bacteria huésped. En el caso del plásmido como vehículo portador del módulo de expresión es necesario ejercer una presión de selección para evitar la segregación plasmídica, generalmente con un antibiótico. Por el contrario, en la versión integrativa el módulo de expresión no requiere el uso de antibióticos para retener el vector en la célula pero el nivel de expresión es significativamente inferior.

La acción coordinada de todos los elementos constituyentes del circuito de cascada transcripcional conducen a la amplificación de la expresión de la proteína recombinante de interés industrial o farmacéutico. El circuito se inicia en presencia de un agente químico activador de la proteína NahR, como por ejemplo el activador natural salicilato. El salicilato o algunos derivados aromáticos del mismo se unen a la región central de la proteína activándola. La proteína NahR activa se une al promotor diana Psal y promueve la amplificación transcripcional(12) del gen xylS. Finalmente, la proteína codificada por este gen, XylS, activa la expresión del gen de interés regulado por el promotor Pm de dos maneras alternativas: por aumento de los niveles intracelulares del regulador XylS o bien por la presencia del agente químico activador de XylS, como es el caso del benzoato o derivados(11). Recientemente se ha descrito un posible mecanismo de funcionamiento de la unión del regulador XylS al promotor Pm, en el que se indica que XlyS se une a regiones promotoras de Pm en forma de dímeros y que la formación de estos dímeros es consecuencia de la unión de un agente químico activador (benzoato o derivados) o por incremento de la concentración proteica de XylS por encima de un valor umbral(11). En la Figura 1 de la página anterior se muestra un esquema del funcionamiento del sistema en Cascada y del sistema pET.


(|Figura 1. Representación esquemática del módulo de regulación y del módulo de expresión del sistema de expresión en Cascada (A) y del sistema de expresión pET (B).
|)

Como se ha mencionado, el funcionamiento del sistema en cascada requiere el uso de dos compuestos químicos activadores de las proteínas NahR y XylS, salicilato y benzoato o derivados, respectivamente. Sin embargo, se ha estudiado la posibilidad de activación de las proteínas NahR y XylS con un único agente químico. Como resultado se han obtenido versiones modificadas de NahR y XylS que responden a la acción de un único activador químico, bien salicilato, bien benzoato(10,12). Este aspecto ha sido desarrollado y comercializado como un sistema en cascada activado exclusivamente con salicilato en el que el módulo regulador está constituido por XylS2, un mutante de XylS(12), en lugar del regulador XylS nativo(13). Sin embargo, en nuestros laboratorios hemos observado, mediante ensayos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y posterior secuenciación del producto amplificado, que el gen que codifica para XylS2 no está presente en el módulo regulador portado en las cepas comerciales de expresión del sistema en cascada, sino que el gen contenido es el gen nativo, xylS, insensible a la acción del salicilato. En nuestros laboratorios hemos caracterizado el sistema de expresión utilizando las cepas comerciales portadoras del módulo regulador de la expresión proteica: MPO12, REG-1, y una tercera cepa no comercial: Medal Fold. MPO12 es una cepa de E. coli K-12 silvestre resistente a rifampicina(14), REG-1 es una cepa E. coli K-12 con el genotipo similar a la cepa de clonación TOP10 (Invitrogen), y Medal Fold es una cepa E. coli derivada de BL21 C41 (DE3) deficiente en las proteasas OmpT y Lon, y que además contiene una mutación adicional no caracterizada que aumenta los niveles de expresión de proteínas de membrana y tóxicas(15).

En primer lugar, utilizando la cepa MPO12, que incorpora el módulo regulador del circuito en cascada de expresión génica, y un plásmido que contiene el módulo de expresión y un gen codificante para una proteína terapéutica, hemos desarrollado un método de cultivo discontinuo en biorreactor y un medio de cultivo definido que permite a esta cepa crecer hasta densidades ópticas superiores a 200 unidades de absorbancia a 600 nm, equivalente a 300 gramos de biomasa por litro de cultivo, aproximadamente. Sin embargo, la inducción con salicilato de la expresión de la proteína de interés en ese mismo sistema de expresión cuando el cultivo alcanzó una densidad óptica de 146 unidades, dio lugar únicamente a un 4 % de proteína de interés respecto a la proteína total. Este bajo rendimiento de la expresión se explicaría por el desacoplamiento de la supuesta inducción en cascada por efecto del salicilato. Debido a que el salicilato únicamente es capaz de activar el primer elemento del módulo regulador del sistema en cascada y XylS es dependiente del benzoato o derivados, sería posible incrementar el rendimiento combinando los agentes químicos activadores de los dos elementos del módulo regulador. Para ello, hemos realizado una serie de experimentos utilizando una proteína modelo, GFP (green fluorescent protein), contenida en un plásmido multicopia y una cepa que tiene el módulo regulador del sistema de expresión integrado en el cromosoma. En estos ensayos hemos aplicado distintas combinaciones de inductores de los reguladores NahR y XylS para inducir la expresión de la proteína GFP. Como se observa en la Figura 2 cuando aumenta la concentración de salicilato se observa un incremento en el nivel de expresión de GFP. El mismo resultado se registra cuando aumenta la concentración de un derivado del benzoato. Asimismo, la combinación de los dos inductores genera un nivel de expresión de GFP superior al efecto producido por la suma de los efectos producidos por los inductores cuando se adicionan por separado, lo cual indica que la combinación de los inductores tienen un efecto sinérgico sobre la expresión de la proteína ensayada.


(|Figura 2. Cinética de inducción de la expresión de la proteína GFP con varias combinaciones de los inductores del sistema de expresión en Cascada.
|)

Una vez demostrada la capacidad de expresión del sistema en cascada y comprobado el efecto sinérgico de la combinación de los agentes químicos inductores sobre la expresión de la proteína GFP, aplicamos el circuito de cascada transcripcional a dos proteínas de interés biofarmacéutico. Los genes codificantes para ambas proteínas se subclonaron en sendos plásmidos de expresión bajo el control del promotor Pm, constituyendo el módulo de expresión. A continuación, los plásmidos generados se trasformaron por separado en una cepa portadora del módulo regulador del sistema en cascada y se llevó a cabo, en paralelo, una cinética de inducción de la expresión de las dos proteínas tras adición de diferentes concentraciones de los inductores salicilato y un derivado del benzoato. Como se puede observar en la Figura 3 la combinación de los activadores de NahR y XylS generan niveles de expresión superiores a los detectados con salicilato únicamente. Además, se obtienen niveles de expresión entre 20 y 25 % de la proteína de interés respecto a la proteína total expresada por las bacterias. Estos niveles de expresión son comparables a los niveles obtenidos con el sistema de expresión pET y pRSET.


(|Figura 3. Cinética de inducción de la expresión de la proteína recombinante a tiempo 0, 3 y 5 hora tras la adición del inductor salicilato, un derivado del benzoato y distintas combinaciones de ambos inductores del sistema en Cascada.|)

En la actualidad, DRO Biosystems está llevando a cabo una serie de mejoras del sistema de expresión en cascada en la cepa y el plásmido de expresión. En la configuración del sistema de expresión utilizado hasta el momento la retención del plásmido se consigue por medio de antibióticos como elementos de presión selectiva, lo que supone un inconveniente durante el desarrollo de un proceso de producción de un fármaco destinado al consumo humano. El uso de antibióticos se puede evitar mediante la creación de una auxotrofía en la cepa de expresión para un determinado componente esencial de la célula, como es el caso de un aminoácido. Gracias a la mejora en las técnicas de ADN recombinante dedicadas a la manipulación genética es posible la interrupción de un determinado gen o región cromosómica bacteriana mediante un método sencillo basado en la recombinación homóloga(16). La auxotrofía generada en la cepa de expresión puede ser complementada en el plásmido de expresión por la región cromosómica nativa que ha sido modificada, de forma que solo las células portadoras del plásmido de expresión con la secuencia de complementación podrían crecer en un medio de cultivo carente del elemento para el que la cepa es auxótrofa.

Por otra parte, también se está mejorando el plásmido de expresión utilizando como base plásmidos de número de copias controlado para incrementar el rendimiento en proteína de intéres por célula, evitar el empleo de antibióticos como agentes de selección y con un sitio de clonaje múltiple más completo para facilitar el proceso de subclonación de la secuencia de interés. BM


Notas

1. Wildt, S.; Gerngross, T.U. Nat Rev Microbiol, 2005, 3(2), 119-28.

2. Hamilton, S.R.; Davidson R.C.; Sethuraman N.; Nett J.H.; Jiang Y.; Rios S.; Bobrowicz P.; Stadheim T.A.; Li H.; Choi B.K.; Hopkins D.; Wischnewski H.; Roser J.; Mitchell T.; Strawbridge R.R.; Hoopes J.; Wildt S.; Gerngross T.U. Science, 2006, 313(5792), 1441-3.

3. Jarvis, D.L. Virology, 2003, 310(1), 1-7.

4. de Marco, A. Microb Cell Fact, 2009 14;8:26.

5. Makrides, S.C. Microbiol Rev, 1996, 60(3), 512-38.

6. Sørensen, H.P.; Mortensen, K.K. J Biotechnol, 2005, 115(2), 113-28.

7. Vidal, L.; Pinsach, J.; Striedner, G.; Caminal, G.; Ferrer, P. J Biotechnol, 2008, 134(1-2):127-36.

8. Schell, M.A.; Poser, E.F. J Bacteriol, 1989, 171, 837-846.

9. Park, W.; Padmanabhan, P.; Padmanabhan, S.; Zylstra, G.J.; Madsen, E.L. Microbiology, 2002, 148(Pt 8), 2319-29.

10. Cebolla, A.; Sousa, C.; de Lorenzo V. J Biol Chem, 1997, 272(7), 3986-92.

11. Domínguez-Cuevas, P.; Marín, P.; Busby, S.; Ramos, J.L.; Marqués, S. J Bacteriol, 2008, 190(9), 3118-28.

12. Ramos, J.L.; Michan C.; Rojo, F.; Dwyer, D.; Timmis K. J Mol Biol, 1990, 211(2), 373-82.

13. Patente ES 2 228 541 T3

14. Royo, J.L.; Moreno-Ruiz, E.; Cebolla, A.; Santero, E. J Biotechnol, 2005, 116(2), 113-24.

15. Miroux, B.; Walker, J.E. J Mol Biol, 1996, 260, 289-298.

16. Datsenko, K.A.; Wanner, B.L. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000, 97(12), 6640

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Comentarios
  • Rob 18 septiembre, 2013

    Gracias por la información. Podrian decirme el nombre del o los autores y el año por favor?, Gracias!

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