Nueva forma de entender y tratar la inflamación

El A?cido docosahexanoico (DHA, 22:6 n-3) se encuentra de forma enriquecida en sistema nervioso central (SNC) y particularmente en retina, siendo enzimA?ticamente transformado en docosanoides prohomeostA?ticos. En A�ste original describimos el descubrimiento y la caracterizaciA?n de una nueva clase de mediadores lipA�dicos denominados elovanoides (ELVs), que son derivados dihidroxilados de 32:6 n-3 y 34:6 n-3 en retina y cerebro. Los ELVs se producen en una vA�a de elongaciA?n de un A?cido graso n-3 catalizado por ELOVL4. Acidos grasos de 26 carbonos derivados del DHA o del A?cido eicosapentanoico (EPA) representan sustratos para la elongasa ELOVL4, que se expresa en cA�lulas fotorreceptoras y en neuronas, generando A?cidos grasos poliinsaturados de cadena largaA� (a�?C28) incluyendo n-3 (VLC-PUFAs, n-3), como 32:6 n-3 y 34:6 n-3. Si bien mutaciones en ELOVL4 causan pA�rdida de visiA?n o la disfunciA?n neuronal, el papel de los VLC-PUFAs, n-3 y sus posibles derivados permanecen aA?n desconocidos (1).

La estructura y estereoquA�mica de los ELVs, establecida mediante sA�ntesis estereocontrolada, estA? correlacionada con una visiA?n general de la bioactividad de estos nuevos mediadores. AsA� se ha demostrado que los ELVs consiguen a) protecciA?n en cultivos neuronales con privaciA?n de glucosa a�� oxA�geno o en excitotoxicidadA� mediada por el receptorA� N-metil-D-aspartato (NMDA); b) neuroprotecciA?n en el accidente cerebrovascular isquA�mico experimental al reducir el volumen de la lesiA?n, e incrementando la supervivencia celular y atenuando las alteraciones neurovasculares (barrera hematoencefA?lica), tras inyecciA?n intracerebral de ELVs una hora despuA�s de inducir la isquemia por oclusiA?n de la arteria cerebral media; c) incremento en proteA�nas antiapoptA?ticas y disminuciA?n de las proapoptA?ticas, atenuando de A�ste modo la apoptosis de cA�lulas sometidas a estrA�s oxidativo no compensado; d) protecciA?n de las cA�lulas del epitelio pigmentario de la retina (EPR), que mantiene la integridad der las cA�lulas fotorreceptoras en modelos experimentales de degeneraciA?n de retina (2).

Estos hallazgos muestran una nueva vA�a de seA�alizaciA?n celular autocrina/paracrina pro-homeostA?tica en relaciA?n con el mantenimiento de la integridad de las cA�lulas neuronales, al tiempo que muestran nuevas potenciales avenidas terapA�uticas en la degeneraciA?n de retina, accidentes cerebro vasculares y enfermedades neurodegenerativas.A�A�A�A�

IntroducciA?n:

Las respuestas celulares y moleculares que se activan en el inicio y progresiA?n de las enfermedades representan un importante factor de perturbaciA?n de la homeostasis (3,4) y que en general las relacionamos con la inflamaciA?n. El inicio de los mecanismos de defensa abarca la generaciA?n de mediadores protectores, incluyendo los lA�pidos bioactivos (5-9); la activaciA?n de cA�lulas del sistema inmune, neuronas, astrocitos y cA�lulas EPR entre otras, con el objetivo de mantener la homeostasis, eliminar los factores desencadenantes implicados y los materiales derivados del metabolismo tA?xico celular; con el fin de conseguir el restablecimiento de la funcionalidad celular y tisular. La importancia de la seA�alizaciA?n pro homeostA?tica es objeto de estudio en la activaciA?n de cA�lulas EPR, cA�lulas fotorreceptoras (PRC) y probablemente en otras cA�lulas retinianas en el inicio de alteraciones, como el estrA�s oxidativo no compensado (UOS), la degeneraciA?n retiniana (10-12) y enfermedades neurodegenerativas.

a�?Los elovanoides son mediadores protectores y restauradores de la homeostasis neuronal tanto en accidentes cerebrovasculares como en neurotrauma y enfermedades neurodegenerativas a�?

El SNC es rico en A?cidos grasos poliinsaturados (PUFAs) omega-3 (n-3) y cadenas acilo de fosfolA�pidos de membrana. Dentro de la familia de los omega-3, el A?cido docosahexanoico (DHA, 22:6 n-3) es el PUFA mA?s abundante y sirve de precursor de derivados dihidroxilados enzimA?ticos que se conocen genA�ricamente como docosanoides y entre los que se incluyen potentes mediadores neuroprotectores, sintetizados a�?a demandaa�? cuando la alteraciA?n de la homeostasis es inminente (3,4) y que responden a una nueva clase de mediadores lipA�dicos dihidroxilados que hemos denominado como elovanoides (ELV) y que derivan de VLC-PUFA, n-3 con 32 A? 34 A?tomos de carbono y presumiblemente cadenas de A?cidos grasos mA?s largas, que ponen en marcha un nuevo mecanismo de seA�alizaciA?n pro homeostA?tico y neuroprotector, que se activa ante una inminente alteraciA?n de la homeostasis celular.

Estos mecanismos endA?genos pro homeostA?ticos y neuroprotectores difieren de otros anteriormente descritos al implicar a dos diferentes precursores de lA�pidos bioactivos derivados de PUFA y cuyos precursores se almacenan es especies moleculares especA�ficas de fosfatidilcolina. El primero de los precursores de PUFA descrito fue el mediador lipA�dico estereoselectivo dihidroxilado D1 (NPD1) (8-10)A� y debido a la existencia de A?cidos grasos mA?s largos que 34:6 n-3, asA� como de derivados de la acciA?n de otras ELOVL, es conseguridad posible se produzcan otros elovanoides endA?genamente con capacidad de regular la funciA?n celular.

ELOVL4

Esta enzima se expresa en SNC, particularmente en cA�lulas fotorreceptoras y neuronas, incluyendo hipocampo y lA?bulo temporal medio. La transformaciA?n de DHA o EPA (20:5 n-3) en PUFAs (VLC-PUFAs, n-3) de cadena larga (a�?C28) en cerebro, retina, testA�culos y piel (5) se realiza dirigido por su di-lisina C-terminal (motif KXKXX) al retA�culo endoplA?smico, mediante unA� proceso secuencial de elongaciA?n por condensaciA?n que incorpora malonil CoA y acil CoA produciendo un intermediario 3-ceto-acil-CoA, reducciA?n a 3-hidroxi, deshidrataciA?n para formar un acil-CoA trans 2,3-enoil y un proceso final de reducciA?n que conduce a la formaciA?n del A?cido graso dos C mA?s largo que el precursor. Los pasos de reducciA?n estA?n catalizados por enzimas 3-ceto-acil-CoA reductasa (KAR) y trans-2,3-enoil-CoA reductasa (TER), respectivamente, que requieren NADPH como cofactor. La etapa de deshidrataciA?n se lleva a cabo a travA�s de 3-hidroxiacil-CoA deshidratasas (HACD1, HACD2, HACD3, HACD4) y la longitud de la cadena del producto final se encuentra determinada por la elongasa particular que cataliza la etapa.

La necesidad funcional de la ELOVL4 se encuentra bien documentada en cerebro y retina. En la piel la enzima cataliza la formaciA?n de A?cidos grasosA� VLC saturados que conforman la barrera de permeabilidad necesaria para la supervivencia neonatal (13). La conversiA?n a mediadores bioactivos de los VLC-PUFAs, n-3 que se describe con los ELVs representa un avance transformador en el seA�alamiento celular.

Mutaciones ELOVL4

Las mutaciones ELOVL4 son causa de una enfermedad autosA?mica dominante conocida como sA�ndrome de Stargardt, una forma juvenil de degeneraciA?n macular con pA�rdida de visiA?n central, degeneraciA?n progresiva de laA� retina (14-23) y defectos tempranos en las cA�lulas EPR y PRCs (22). La ausencia de seA�al de retenciA?n ELOVL4 C-terminal en el retA�culo endoplA?smico, conduce a una localizaciA?n errA?nea de la proteA�na ELOVL4, a su agregaciA?n (14-15, 23), estrA�s y muerte celular de los fotorreceptores. Otro posible mecanismo serA�a la formaciA?n de una proteA�na errA?nea ELOVL4 truncada, pero enzimA?ticamente activa, que conducirA�a a la acumulaciA?n de 3-ceto intermedios y otros productos tA?xicos, que reducirA�an aA?n mA?s la capacidad del enzima para generar VLC-PUFAs. Los ratones ELOVL4 KO presentan terminales de fotorreceptores deficientes en VLC-PUFAs. Las mutaciones ELOVL4 en el cerebro se han relacionado la ataxia espinocerebelosa (25-27). Las mutaciones ELOVL4 recesivas perturban el desarrollo del sistema nervioso, conllevando a a una disfunciA?n neuronal, hiperexcitabilidad y convulsiones (23, 28), asA� como a otros trastornos neurolA?gicos.

Destino de los VLC-PUFAs generados vA�a ELOVL4

Los VLC-PUFAs se incorporan a los fosfolA�pidos en el segmento interno de PRC, emn el case de la retina, donde se realiza la biogA�nesis de la membrana externa de las PRC (16) interactuando estrechamente con la rodopsina. Los VLC-PUFAs son vitales en las funciones de los PRC, incluyendo longevidad, funciA?n sinA?ptica y conectividad neuronal; pero sin embargo los mecanismos moleculares por los que se ejercen estas funciones y su papel protector se mantienen en la actualidad en el desconocimiento. Con el fin de aclarar en parte estos mecanismos y la importancia de la ELOVL4 en la supervivencia del PRC , acudimos a la ablaciA?n genA�tica del receptor de la adiponectina 1 (AdipoR1) que conduce a un agotamiento de las especies moleculares de fosfatidilcolina (PCMS) que contienen 32:6 n-3, 34:6 n-3 y DHA (22:6 n-3) y conlleva a la degeneraciA?n de los fotorreceptores , de un modo similar a lo que acontece en algunas de las de las enfermedades humanas degenerativas de la retina. En consecuencia, una escasez en los mediadores protectores bioactivos derivados de los VLC-PUFAs podrA�a representar un factor fundamental en el inicio y la progresiA?n temprana de este tipo de patologA�as.

a�?Una escasez en los mediadores protectores bioactivos derivados de los VLC-PUFAs podrA�a representar un factor fundamental en el inicio y la progresiA?n temprana de este tipo de patologA�asa�?

FormaciA?n, estructura y estereoquA�mica de los elovanoides:

Cultivos de cA�lulas neuronales

Las estructuras completas y la estereoquA�mica de los nuevos elovanoides ELV-N32 y ELV-N34 se establecieron mediante la sA�ntesis orgA?nica total estereocontrolada mediante una adaptaciA?n de nuestro anterior procedimiento de sA�ntesis de NPD1 (11). Se obtuvieron estructuras y estereoquA�mica de ELVs completamente definidas con la configuraciA?n R/S completa, asA� como la geometrA�a Z/E de los dobles enlaces de los compuestos generados por cA�lulas neuronales en cultivo.

Los ELVs y sus precursores se identificaron en cultivos de cA�lulas neuronales sometidos a OGD. Tras el emparejamiento de ELVs sintA�ticos quA�micos obtenidos con los ELVs biogA�nicos derivados de cA�lulas neuronales en cultivo, se estableciA? la estructura completa y la estereoquA�mica de ELV-N32 y ELV-N34. Las estructuras de ELV-N32 (elovanoide derivado de un A?cido graso poliinsaturado omega-3 de 32-carbonos) y ELV-N34 (elovanoide derivado de un A?cido graso poliinsaturados omega-3 de 34-carbonos) se determinA? que eran: ELV-N32:(14Z, 17Z, 20R, 21E, 23E, 25Z, 27S, 29Z) -20,27-dihidroxi-triaconta-14,17,21,23,25,29 -A?cido hexanoico (Fig. 1E); ELV-N34:(16Z, 19Z, 22R, 23E, 25E, 27Z, 29S, 31Z)-22,29-dihidroxitetra-triaconta-16,19,23,25,27,31-A?cido hexanoico.

CA�lulas EPR humanas

Las estructuras completas y la estereoquA�mica de los nuevos elovanoides de 32 y 34 carbonos ELV-N32 y ELV-N34 tambiA�n se establecieron por comparaciA?n directa con compuestos preparados mediante sA�ntesis orgA?nica total estereocontrolada, adaptando nuestras metodologA�as previamente documentadas para la sA�ntesis total del mediador lipA�dico derivado de DHA, neuroprotectina D1 (NPD1; 10R,17S- dihidroxidocosa – (4Z, 7Z, 11E, 13E, 15Z, 19Z) -A?cido -hexanoico). La validaciA?n adicional de estas conformaciones estructurales se estableciA? al sintetizar derivados marcados con deuterio (ELV-N32-d2 y ELV-N34-d2) para el anA?lisis de espectrometrA�a de masas en tA?ndem por cromatografA�a lA�quida (LC-MS/MS). ELV-N32 y ELV-N34 se prepararon mediante sA�ntesis quA�mica total estereocontrolada, como ya se indicA? anteriormente para cA�lulas neuronales en cultivo, en cA�lulas EPR primarias humanas. Las imA?genes confocales de cA�lulas EPR humanas primarias utilizando los marcadores especA�ficos ZO-1 (Zona ocludens-1), RPE65, MITF (factor de transcripciA?n asociado a micro-oftalmia) y I?-catenina) asA� como la morfologA�a de microscopA�a A?ptica en diferentes pasajes en cultivo se usaron para caracterizar las cA�lulas. Se confirmaron las estructuras completas de ELV-N32 (de un A?cido graso poliinsaturado omega-3 de 32 carbonos) y de ELV-N34 (de un A?cido graso poliinsaturado de omega-3 de 34 carbonos) y se correlacionaron con las generadas a partir de cultivos neurales (como se indicA? anteriormente).

Papel de los ELVs en la atenuaciA?n de la apoptosis en EPR: incremento de proteA�nas antiapoptA?picas y disminuciA?n de proteA�nas proapoptA?picas

Para contrarrestar la neurodegeneraciA?n, las cA�lulas activan las vA�as neuroprotectoras que mantienen un equilibrio entre la seA�alizaciA?n pro y anti-apoptA?tica. Los mecanismos genA�ticos y celulares por los que se expresan estos eventos de supervivencia, asA� como los mediadores y las vA�as de seA�alamiento en la producciA?n de proteA�nas con acciones protectoras, no se encuentran bien documentados. Los ELVs descubiertos, mejoran la expresiA?n de proteA�nas pro-supervivencia y pro-homeostA?ticas en cA�lulas EPR sometidas a UOS. En estas condiciones, ELV-N32 y ELV-N34 regulan el incremento de las proteA�nas SIRT1 e Iduna. Las sirtuinas estA?n implicadas en enfermedades de retina, en el envejecimiento, la funciA?n mitocondrial y la homeostasis general. Iduna es una ligasa ubiquitina asociada al control de calidad de las proteA�nas y reparaciA?n del ADN, y facilita la protecciA?n contra partanatos, una forma de muerte celular dependiente de poli(ADP-ribosa) polimerasa-1 (PARP -1). Las PARPs catalizan la transferencia de ADP-ribosa desde el NAD a proteA�nas y son indispensables para la integridad genA?mica, el ciclo celular y la expresiA?n gA�nica. Recientemente, se ha demostrado que NPD1 incrementaA� Iduna en cA�lulas EPR cuando se enfrenta con UOS.

Los ELVs provocan estos efectos relacionados con la bioactividad al aA�adirse a muy bajas concentraciones, del orden de nM. Los ELVs tambiA�n potenciaron un incremento en las proteA�nas antiapoptA?ticas Bcl-2 y Bcl-xL y contrariamente, Bax, Bid y Bim proteA�nas pro-apoptA?ticos se redujeron por los ELVs. La prohibitina (tipo 1), una proteA�na de supervivencia celular, es regulada al alza mediante ELVs en cA�lulas EPR sometidas a UOS lo que sugieren que los ELVs juegan un papel importante en la seA�alizaciA?n celular (7,15). Esta observaciA?n de incremento de la regulaciA?n por los ELVs de la prohibitina (tipo 1) tiene un elevado interA�s en la biologA�a de la senescencia y la supervivencia celular. Las prohibitinas son proteA�nas omnipresentes conservadas evolutivamente que forman un complejo anular de alto peso molecular en la membrana interna de las mitocondrias y otros compartimentos celulares A�encontrA?ndose tambiA�n involucrados en el metabolismo energA�tico, la proliferaciA?n celular, la apoptosis y la senescencia (25). La prohibitina regula la seA�alizaciA?n del transporte de la membrana, el control de la activaciA?n de la transcripciA?n y el ciclo celular, mientras que el complejo prohibitina mitocondrial estabiliza el genoma mitocondrial y modula la dinA?mica mitocondrial, la morfologA�a, la biogA�nesis y la vA�a apoptA?tica intrA�nseca. Por lo tanto, la posibilidad de manipulaciA?n en relaciA?n a la abundancia intracelular de prohibitina (tipo-1) porA� los ELVs representan un nuevo modulador de la senescencia y de otras funciones pro-homeostA?ticas clave en las cA�lulas de mamA�feros.

AdipoR1: regulaciA?n de la captaciA?n celular de DHA y la formaciA?n de ELVs

Las cA�lulas EPR mantienen la integridad funcional de la PRC, y su pA�rdida estA? involucrada en varias formas de degeneraciones retinianas. Una de las funciones de la cA�lula EPR es recuperar DHA durante la renovaciA?n de PRC y devolverla a travA�s de la matriz de interfotorreceptores al segmento interno del PRC para la nueva biogA�nesis de la membrana de disco de segmento externo. Recientemente hemos descrito que el receptor de adiponectina 1 (AdipoR1) es necesario en la disponibilidad de DHA para las cA�lulas fotorreceptoras, y una A?nica mutaciA?n de aminoA?cido en este receptor es la causa de la retinosis pigmentaria autosA?mica dominante. La ablaciA?n genA�tica de este receptor conduce a la degeneraciA?n de la PRC y a la eliminaciA?n de la sA�ntesis en la retina de VLC-PUFA, n-3. Nuestra experimentaciA?n demostrA? que el tamaA�o del conjunto de 32:6 n-3 libre y de 34:6 n-3 en las retinas de ratones AdipoR1 knockout (KO)A� se reduce drA?sticamente en comparaciA?n con el control. AdemA?s, ELV-N32 y ELV-N34 en KOA� eran indetectables. El mono-hidroxi 32:6 n-3 y 34:6 n-3, los derivados estables de los precursores hidroperoxi de ELV-N32 y de ELV-N34, respectivamente, carecen de una seA�al detectable en el KO, a diferencia de la del control; encontrandose que ELV-N32 y ELV-N34 se secretaban de las cA�lulas EPR cuando se sometA�an a UOS, lo que sugiere una bioactividad paracrina o autocrina. TambiA�n se demostrA? que estos ELVs incrementan la expresiA?n de proteA�nas pro-supervivencia y pro-homeostA?ticas en las cA�lulas EPR sometidos a UOS.

Los ELV protegen las cA�lulas EPR, que mantienen la integridad de la CRP

El alargamiento de las PUFA en el segmento interno de los fotorreceptores mediante ELOVL4 conduce a la biosA�ntesis de VLC-PUFAs, n-3 y su inserciA?n en la posiciA?n C1 de la fosfatidilcolina dentro de las membranas del disco del PRC. Sin embargo, en condiciones de estrA�s, estos VLC-PUFA se escinden mediante la acciA?n de la fosfolipasa A1 (PLA1) para la sA�ntesis de VLC-PUFA (ELV) mono y dihidroxi. El estrA�s oxidativo inducido por la luz en las retinas de ratones desencadena la producciA?n de 32:6 n-3 y 34:6 n-3 libres, asA� como de sus derivados mono- y di-hidroxi. En ratones AdipoR1 KO, no se encontraron cantidades detectables de estas molA�culas. Por lo tanto, la falta de VLC-PUFA, n-3; el precursor de DHA da como resultado la degeneraciA?n retiniana, precedida por una notable regulaciA?n a la baja de las especies moleculares VLC-PUFA, n-3A� libres y la biosA�ntesis de ELVs. Estas observaciones apoyan nuestra hipA?tesis actual de que los VLC-PUFA, n-3 son precursores de nuevos mediadores bioactivos que provocan bioactividad protectora pro-homeostA?tica.

Bioactividad neuroprotectora de los ELVs frente al estrA�s oxidativo no compensado, la privaciA?n de oxA�geno/glucosa o activaciA?n del receptor NMDA

Los ELVs consiguen neuroprotecciA?n en cultivos de cA�lulas neuronales mixtos cerebro-corticales o cultivos mixtos de neuronas del hipocampo, expuestos durante 12 horas a estrA�s oxidativo no compensado,A� inducido por adiciA?n de factor de necrosis tumoral alfa (TNFE�) a 10 ng/ml y H₂O₂.

NMDA (25-100 I?M durante 12 horas) indujo la muerte neuronal en cA�lulas neuronales mixtas cerebro-corticales y neuronas mixtas del hipocampo en cultivo. La excitotoxicidad de NMDA se consiguiA? superar mediante la adiciA?n de un antagonista del receptor NMDA no competitivo MK801 maleato. La adiciA?n de MK801 y ELVs asociados obtuvo una neuroprotecciA?n mA?s potente que la provocada solo por ELVs.

AtenuaciA?n del daA�o celular por los ELVs, integridad vascular y barrera sanguA�nea y recuperaciA?n neurolA?gica tras accidente cerebrovascular isquA�mico experimental

El accidente cerebrovascular isquA�mico perturba las funciones sensoriomotoras y cognitivas en una gran proporciA?n de pacientes que presentan hemiparesia temprana. Los ELVs administrados por cA?nulas implantadas estereotA?xicamente en el ventrA�culo lateral derecho, una hora despuA�s de la oclusiA?n durante dos horas de la arteria cerebral media (MCAo) atenuaron notablemente los dA�ficits sensoriomotores funcionales. AdemA?s y dado que el principal objetivo terapA�utico en enfermedades cerebrovasculares es la restauraciA?n de las funciones neurolA?gicas, dos pruebas de la baterA�a sensorimotora se seleccionaron para detectar dA�ficits neurolA?gicos tras accidente cerebrovascular isquA�mico experimental inducido (29). Todos los animales tratados con ELVs mejoraron en gran medida las puntuaciones neurolA?gicas de forma sostenida hasta el perA�odo de supervivencia de 7 dA�as, observA?ndose una reducciA?n significativa del volA?men de las lesiones con ELV-N32 Na, ELV-N32 Me, ELV-N34 Na y ELV-N34 Me, localizA?ndose principalmente las mismas en las A?reas subcorticales del cerebro y comparativamente con el grupo control.

Neuronas, astrocitos y vasos sanguA�neos implicados en el infarto cerebral se examinaron mediante inmunohistoquA�mica el dA�a 7 y comparadas con el grupo control. Las ratas tratadas con ELVs incrementaron los recuentos celulares de elementos neuronales, gliales y vasculares (neuronas NeuN-positivas, astrocitos reactivos positivos para GFAP y vasos positivos a SMI-71). El resultado final es queA� todos los tratamientos ELVs (excepto ELV-N32 Na), incrementan la densidad de los vasos sanguA�neos (SMI-71) dentro de los tejidos penumbrales, con la formaciA?n paralela de tejido cicatricial rico en GFAP mA?s denso y por tanto, el incremento de la densidad de los vasos sanguA�neos probablemente facilite la neurogA�nesis y la sinaptogA�nesis, lo que a su vez contribuye a una reparaciA?n y recuperaciA?n funcional mejorada.

En la medida de la alteraciA?n isquA�mica de la unidad neurovascular (NVU) se acudiA? inicialmente a la infiltraciA?n de IgG endA?gena en el parA�nquima cerebral, observando la intensidad de tinciA?n de IgG en el hemisferio ipsilateral despuA�s de MCAo a los 7 dA�as, entre los grupos tratados con los ELVs (ELV-N32 Na, ELV-N32 Me, ELV-N34 Na, ELV-N34) y el grupo control. El tratamiento con ELV-N34 Na y ELV-N34 Me, mostrA? significativamente menos tinciA?n de IgG en la corteza;A� localizA?ndose principalmente en el nA?cleo del infarto (subcorteza) y mostrando ademA?s una reducciA?n de la inmunorreactividad de la IgG de todo el hemisferioA� (todos los animales sobrevivieron sin incidentes). El tamaA�o del infarto en las ratas tratadas con ELVs mostrA? un daA�o menos extenso, principalmente en el A?rea subcortical y la protecciA?n mediada por los ELVs fuA� extensa en la corteza frontal-parietal (el tejido se recuperA? en un 57-96%) y subcorteza (73-75%) en comparaciA?n con el grupo control. El volumen de infarto total, corregido para el edema cerebral, se redujo drA?sticamente en todos los grupos tratados con ELVs en un 55-91%.

A�La mayorA�a de los accidentes cerebrovasculares son de naturaleza isquA�mica (18) y la privaciA?n de oxA�geno y glucosa conduce a una cascada de eventos que implican daA�o mitocondrial, y que finalmente conducen a la muerte neuronal. El modelo de OGD a�?in vitroa�? consigue detectar los eventos celulares y las vA�as de seA�alizaciA?n neuroprotectoras subyacentes en las que participan los ELVs. La demostraciA?n de que tanto ELV-N32 como ELV-N34 provocan neuroprotecciA?n y superan la citotoxicidad neuronal y que el precursor VLC-PUFA (C32:6 n-3) omega-3 de 32 carbonos de los ELVs, cuando se aplicaba a una dosis de 250 nM en las dos horas de la fase de reoxigenaciA?n tras 90 minutos de agresiA?n OGD, proporciona neuroprotecciA?n a las neuronas corticales cerebrales. En conclusiA?n, los elovanoides generados endA?genamente (ELV-N32 o ELV-N34) mejoraron la lesiA?n neuronal inducida por distintos factores estresantes, como activaciA?n del receptor NMDA, estrA�s oxidativo no compensado u OGD en cultivos de neuronas mixtas cerebro corticales yA� neuronas mixtas del hipocampo.

Los ELVs, administrados una hora despuA�s, tras las dos horas de la inducciA?n del accidente cerebrovascular isquA�mico experimental, mejoraron la recuperaciA?n neurolA?gica durante el perA�odo de supervivencia de 7 dA�as y las imA?genes de resonancia magnA�tica (MRI) mostrA? los cambios en el contenido y la difusiA?n de agua, que caracterizan el accidente cerebrovascular isquA�mico agudo (30). La rA?pida inducciA?n del edema cerebral despuA�s de la isquemia focal es la causa principal de morbilidad y muerte tras el accidente cerebrovascular (24). Los ELVs mostraron una protecciA?n mA?xima en la corteza (el A?rea penumbral) y tambiA�n en el A?rea subcortical.

La isquemia cerebral inicia una compleja cascada de eventos celulares, moleculares y metabA?licos que conducen al daA�o cerebral irreversible (25,33,34). Las neuronas muertas y el tejido lesionado son eliminados por las microglia y/o macrA?fagos residentes que invaden el tejido daA�ado del torrente sanguA�neo. Los astrocitos supervivientes y las microglA�a activadasA� pueden facilitar la restauraciA?n de la integridad neuronal al producir factores de crecimiento, citoquinas y molA�culas de matriz extracelular implicadas en los mecanismos de reparaciA?n (17). Nuestros resultados demuestran que el tratamiento con ELVs incrementA? el nA?mero de neuronas NeuN-positivas, astrocitos reactivos GFAP-positivos y la densidad de vasos sanguA�neos SMI-71-positivos en la corteza. La integridad de los vasos sanguA�neos facilita la neurogA�nesis y la sinaptogA�nesis, lo que a su vez contribuye a una recuperaciA?n funcional mejorada.

A?EstA? implicada la neurogA�nesis en la acciA?n de los ELVs?

La neurogA�nesis se mantiene tras el nacimiento, siendo la lesiA?n uno de sus inductores (25) tal y como lo demuestran las nuevas neuronas de progenitores en la zona subgranular de la circunvoluciA?n dentada (GD), zona subventricular (ZSV) de algunas A?reas corticales, la sustancia negra y las A?reas periinfartadas (17). Las cA�lulas madre neurales (NSC) persisten en la SVZ del cerebro anteriorA� dentro de un nicho que contiene cA�lulas endoteliales que podrA�an estimular la expansiA?n de NSC y la neurogA�nesis. El accidente cerebrovascular isquA�mico mejora la neurogA�nesis y la angiogA�nesis, pero los mecanismos de cA?mo las cA�lulas endoteliales influyen en la neurogA�nesis inducida por el accidente cerebrovascular no estA?n claras. El proceso principal de los NPCs migratorios estA? estrechamente relacionado con los vasos sanguA�neos, lo que sugiere que esta interacciA?n proporciona una guA�a direccional a los NPCs (25). El origen de los vasos reciA�n formados y la importancia de la neovascularizaciA?n y la neurogA�nesis son importantes cuestiones sin respuesta para llegar a entender la fisiopatologA�a del accidente cerebrovascular y como contribuir a la recuperaciA?n. Tras el accidente cerebrovascular isquA�mico, la integridad de la NVU se ve comprometida, lo que permite el acceso de las molA�culas al parA�nquima lo cual empeora el daA�o (20). Los ELVs, recientemente identificados, protegen las neuronas sometidas a la OGD o la excitotoxicidad mediada por el receptor NMDA. AdemA?s, los ELVs atenuaron los volA?menes de infarto, rescataron el nA?cleo y penumbra isquA�mico, disminuyeron el daA�o de la NVU y promovieron la supervivencia celular acompaA�ada de una recuperaciA?n neurolA?gica/conductual. Es razonable proponer que la nueva terapia con ELVs tenga un importante valor potencial para tratar el accidente cerebrovascular isquA�mico focal y otras afecciones que comprometen las alteraciones inflamatorias/homeostA?ticas.

Observaciones finales

El original muestra el descubrimiento de elovanoides (ELVs), los primeros mediadores lipA�dicos bioactivos derivados de VLC-PUFA, n-3, que son los productos biosintA�ticos de la elongasa ELOVL4. Se ha establecido la estructura y la estereoquA�mica de los ELVs de 32 y 34 carbonos (ELV-N32, ELV-N34) utilizando materiales sintA�ticos obtenidos por sA�ntesis total estereocontrolada. La disponibilidad de los ELVs estA? abolida en las retinas de ratones con AdipoR1 genA�ticamente ablacionado. El DHA dietA�tico (o derivado de la 18:3 n-3 de la dieta) es suministrado a los tejidos por el hA�gado y capturado por AdipoR1, que tras elongaciA?n en el segmento interno de las cA�lulas fotorreceptoras por ELOVL4A� se transforma en VLC-PUFA, n-3 e incorpora a las especies moleculares de fosfatidilcolina, que tambiA�n estA?n dotados de DHA. ELOVL4 usa EPA como sustrato preferido (35), a pesar del hecho de que la abundancia de EPA es muy baja en la retina en comparaciA?n con el DHA. Se ha demostrado la retroconversiA?n de DHA a EPA en los peroxisomas, y la EPA generada por esta reacciA?n podrA�a generar el PUFA de 26 carbonos que es el sustrato para ELOVL4 (35). Durante la renovaciA?n diaria del segmento externo de la PRC, estas especies moleculares de fosfatidilcolina interactA?an con la rodopsina A�y tras procesos de liberaciA?n y fagocitosis, retornan en parte a las cA�lulas EPR. Las alteraciones de la homeostasis desencadenan la liberaciA?n de VLC-PUFA.

Los ELVs se biosintetizan en cA�lulas de EPR humanas y tienen funciones de protecciA?n en cA�lulas de EPR sometidas a USO. Los objetivos de bioactividad de los ELVs en las cA�lulas EPR muestran una elevada funcionalidad pro-homeostA?ticas. El descubrimiento de los ELVs apunta a vA�as previamente desconocidas para preservar la integridad de la PRC. La formaciA?n de ELVs probablemente implica una vA�a de activaciA?n alternativa ya que los VLC-PUFA, n-3 se incorporan en la posiciA?n C1 de los fosfolA�pidos, mientras que el DHA se localiza en la posiciA?n C2. La biosA�ntesis de ELVs, en combinaciA?n con una regulaciA?n alternativa por fosfolipasas A1 y A2 especA�ficas de PRC, apunta a un nuevo mecanismo neuroprotector en la retina y cerebro. No fueron detectados VLC-PUFA n-3 en esfingomielina ni en otros fosfolA�pidos, como fosfatidiletanolamina o fosfatidilserina.

Los datos muestran que la disponibilidad de VLC-PUFA, n-3 libre mA?s UOS conduce a la activaciA?n de eventos pro-homeostA?ticos y citoprotecciA?n de los EPR. Se ha caracterizado la sA�ntesis de los nuevos lA�pidos biosintetizados en estas condiciones, incluyendo el S-precursor y los anA?logos estables hidroxilo derivados. Estas observaciones dan lugar a nuevas preguntas, como: a) A?se modulan las fosfolipasas A1 y A2 de forma coordinada?. b) A?las neurotrofinas son un modulador de las vA�as que originan estas enzimas, como en el caso de la sA�ntesis de NPD1A�A� y si fuera asA�, cA?mo se instruyen las neurotrofinas para escindir C1 o C2?. c) A?Existen sinergias entre NPD1 (u otros docosanoides) y los elovanoides?.

Los nuevos lA�pidos bioactivos ELV descritos (ELV-N32 y ELV-N34) implican la liberaciA?n previa de 32:6 n-3 o 34:6 n-3 desde la posiciA?n C1 de la fosfatidilcolina y dado que esta especie molecular de fosfolA�pidos tambiA�n tiene DHA en la posiciA?n C2, se sugiere que el NPD1 tambiA�n se puede obtener a partir del mismo precursor y por tanto, se postula un mecanismo diferente de bifurcaciA?n de seA�ales que apunta a mantener la integridad de las cA�lulas PRC y EPR, lo cual estA? respaldado por la observaciA?n de que la ablaciA?n genA�tica de AdipoR1, que produce el agotamiento de especies moleculares de PRC que contiene 32:6 n-3 o 34:6 n-3 y DHA en el ratA?n, conduce a la degeneraciA?n de los fotorreceptores y que guarda relaciA?n con diversas formas humanas de enfermedades degenerativas de la retina.

Los ELVs en la degeneraciA?n macular juvenil y otras afecciones neurolA?gicas originada por la ELOVL4 mutante, sugieren un mecanismo alternativo para paliar los efectos nocivos del ELOVL4 mutante, que limitarA�a la apariciA?n de VLC-PUFA, n-3 en la posiciA?n C1 de fosfatidilcolinas y esfingolA�pidos. Por lo tanto, los VLC-PUFAs, n-3 se convierten en los ELVs correspondientes, con actividad protectora de la supervivencia celular en condiciones de UOS. El EPR y la retina, bajo estrA�s continuo, pueden necesitar ELVs para mantener la integridad funcional de las cA�lulas EPR y la funciA?n de las cA�lulas fotorreceptoras: la visiA?n.A�

Las bioactividades de ELV-N32 y ELV-N34 incluyen algunas caracterA�sticas inusuales y A?nicas. AdemA?s de sus potentes acciones neuroprotectoras, estos mediadores lipA�dicos: a) son selectivos de las cA�lulas; b) implican una relaciA?n entre las cA�lulas PRC y EPR que es necesaria para la visiA?n; c) derivan de VLC-PUFA, n-3, cuya biosA�ntesis estA? regulada por una enzima especA�fica del PRC, ELOVL4; d) tienen A?cidos grasos precursores (VLC-PUFA,n-3) que estA?n posicionados como cadenas de acilo en la posiciA?n C1 de la fosfatidilcolina, a diferencia del DHA (el precursor de NPD1), que se incorpora en la posiciA?n C2 y dado que derivan de un precursor de A?cido graso alternativo regulado por ELOVL4 y se almacenan en una posiciA?n de fosfolA�pido alternativa, es probable que los ELVs impliquen una vA�a de activaciA?n alternativa para ejercer su bioactividad neuroprotectora en la retina.

Finalmente se plantea la cuestiA?n sobre el mecanismo de seA�alizaciA?n para las nuevas especies moleculares de fosfatidilcolina que, despuA�s de la liberaciA?n y fagocitosis, aparecen en las cA�lulas EPR. La especie molecular fosfatidilcolina en la cA�lula EPR almacena precursores de dos mediadores lipA�dicos, DHA en la posiciA?n C2, y VLC-PUFA 32:6 n-3 o 34:6 n-3 (los precursores de ELV-N32 y ELV-N34) en la posiciA?n C1. La especie molecular fosfatidilcolina se dirige a la liberaciA?n de las cadenas de acilo en C1 y C2 cuando se enfrentan con UOS como ocurre en el inicio de las degeneraciones de la retina. LosA� ELVs descritos, proporcionan una nueva seA�alizaciA?n de EPR pro-homeostA?tica autocrina/paracrina que apunta a mantener la integridad de las cA�lulas PRC y EPR, revelando asA� el potencial para desarrollar nuevos enfoques terapA�uticos para las degeneraciones de la retina.

Conclusiones

Se han identificado y caracterizado estructuralmente una nueva clase de mediadores lipA�dicos lipoxigenados derivados de 32:6 n-3 o 34:6 n-3 en cA�lulas neuronales, asA� como en cA�lulas de EPR humanas primarias, denominados «elovanoides» (ELVs).

• VLC-PUFA C32:6 y C34:6 son protectores contra UOS en cA�lulas EPR humanas, asA� como en cultivos de las cA�lulas neuronales.
• La protecciA?n contra UOS por VLC-PUFA no estA? bloqueada por inhibidores de la enzima 15 LOX-1. La 15 LOX-1 convierte DHA en NPD1, la bioactividad de VLC-PUFA sugiere que hay diferentes enzimas asociadas con sus propiedades protectoras. 29-hidroxi-34:6 y 22,29-dihidroxi-34:6 derivado de la cA�lula pueden detectarse en cultivos de VLC-PUFA C34:6 a partir de cA�lulas epiteliales de pigmento de la retina humana en cultivo.
• La sA�ntesis quA�mica proporcionA? derivados dihidroxilados estereoquA�micamente puros de VLC-PUFA C32:6 y C34:6, nomenclaturados como elovanoides ELV1 y ELV2, respectivamente.
• Los elovanoides sintA�ticos ELV1 y ELV2 como sales de sodio o A�steres de metilo exhibieron una potente actividad frente a UOS y son diferentes de otros mediadores citoprotectores endA?genos porque, entre otras razones, implican una especie molecular de fosfolA�pidos dotada de cadenas de acilo que son precursoras de lA�pidos neuroprotectores. El DHA, el precursor de los «docosanoides» bioactivos, estA? anclado en la posiciA?n C2 del esqueleto de glicerol, mientras que 32:6 n-3 o 34:6 n-3 estA?n situados en la posiciA?n C1 y sirven como depA?sito de los precursores de los nuevos ELVs.
• La bioactividad de los elovanoides ELV1 y ELV2 fueron correlacionadas con una potente regulaciA?n a la baja de las proteA�nas proapoptA?ticas de la familia Bcl2 Bid, Bim y Bax.
• La bioactividad de los elovanoides ELV1 y ELV2 fueron correlacionadas con una potente regulaciA?n al alza de las proteA�nas antiapoptA?ticas de la familia Bcl2 Bcl-xL y Bcl2.
• VLC-PUFA C32:6 y C34:6 median en la regulaciA?n al alza de SIRT1 en las cA�lulas EPR.
• El elovanoide ELV2 (como la sal de sodio (Na) o A�ster metA�lico (Me)) ejercen una fuerte acciA?n protectora las cA�lulas neuronales en cultivos primarios de la toxicidad inducida por NMDA.
• Los elovanoides sintA�ticos ELV2-Na y ELV2-Me ejercen la potente actividad neuroprotectoraA� a�?in vivoa�? en el accidente cerebrovascular isquA�mico experimental despuA�s de 2 horas de oclusiA?n cerebral media (MCAo). Ambos derivados elovanoides mostraron una mayor potencia a�?in vivoa�? que DHA o NPD1, sugiriendo una notable neuroprotecciA?n y un potencial beneficio terapA�utico para el tratamiento del accidente cerebrovascular isquA�mico y otras enfermedades neurodegenerativas o trastornos
• La mayor potencia del elovanoide ELV2 (como sal de sodio o A�ster metA�lico) frente a los docosanoides (DHA, NPD1) puede deberse a un mecanismo de acciA?n diferente y un perfil metabA?lico diferente que incremente su biodisponibilidad, o a una localizaciA?n alternativa (por ejemplo, receptores intracelulares en la membrana nuclear) debido a su mayor longitud de A?cidos grasos y potencialmente mayor hidrofobicidad y rigidez estructural.

Por Ricardo Palacios PelA?ez,A�David RodrA�guez Gil de Diater Laboratorios y NicolA?s G. BazA?n, Neuroscience Center of Excellence, Louisiana State University Health Sciences Cente