Sistemas de expresiA?n de proteA�nas en Escherichia Coli para la producciA?n de biofA?rmacos. Alternativas y criterios de selecciA?n

IntroducciA?n

De manera anA?loga a lo que ocurre en el mercado de los fA?rmacos clA?sicos con el desarrollo de los fA?rmacos genA�ricos, cuando los biofA?rmacos de marca pierden su protecciA?n industrial debido a la finalizaciA?n del plazo de protecciA?n por patente, aparecen en el mercado fA?rmacos similares para la misma indicaciA?n terapA�utica, pero que debido al gran impacto que la modificaciA?n de los mA�todos de producciA?n pueden tener en la actividad del fA?rmaco, no se denominan genA�ricos, sino biosimilares. Estos biofA?rmacos estA?n registrados conforme a lo establecido por las agencias reguladoras pero tienen un tratamiento particular. Los proveedores del mercado de los biosimilares, en crecimiento y expansiA?n, necesitan disponer de sistemas biolA?gicos de producciA?n robustos y muy productivos, para competir en coste con los biofA?rmacos originales.

Los biofA?rmacos son principalmente proteA�nas recombinantes. Estas proteA�nas se obtienen a partir de organismos vivos, los organismos hospedadores, en los que se ha introducido material genA�tico procedente de otro organismo mediante tA�cnicas de ADN recombinante, de tal manera que el organismo hospedador o huA�sped, emplea su maquinaria biolA?gica para producir la proteA�na cuya secuencia estA? codificada en el ADN introducido artificialmente. Tradicionalmente, la producciA?n de proteA�nas consistA�a en el aislamiento y mejora de las propiedades biolA?gicas de proteA�nas especA�ficas a partir de diversas fuentes naturales, como por ejemplo animales, plantas o microorganismos, para su posterior utilizaciA?n en diversas aplicaciones, terapA�uticas o de otra A�ndole. Gracias al avance en las tA�cnicas de ADN recombinante y al desarrollo de sistemas de expresiA?n de proteA�nas recombinantes ha sido posible producir grandes cantidades de proteA�nas, muchas de las cuales se encuentran en concentraciones muy bajas en su ambiente natural.

La expresiA?n de proteA�nas recombinantes se ha realizado tanto en cA�lulas procariotas como en cA�lulas eucariotas, siendo las primeras las mA?s conocidas y estudiadas. Las cA�lulas eucariotas mA?s utilizadas a nivel industrial son las levaduras (Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae), los hongos filamentosos (Aspergillus niger, Aspergillus oryzae), las cA�lulas de insecto (Drosophila S2) y las cA�lulas de mamA�fero (CHO, HEK, HELA). Las levaduras son fA?cilmente cultivables en medios de cultivo econA?micos y las proteA�nas que producen presentan un elevado grado de homologA�a respecto a los organismos superiores. Sin embargo, las glicoproteA�nas producidas en este huA�sped disponen de un patrA?n de glicosilaciA?n diferente al humano, aunque se han realizado avances en la modificaciA?n de los patrones de glicosilaciA?n de levaduras para conseguir que produzcan proteA�nas recombinantes terapA�uticas con estructuras glicosiladas similares a las humanas(1,2). Las cA�lulas de insecto son A?tiles para el procesamiento de proteA�nas complejas, especialmente glicoproteA�nas, sin embargo, su patrA?n de glicosilaciA?n difiere respecto a las cA�lulas de mamA�fero(3). Finalmente, las cA�lulas de mamA�fero tienen la ventaja de que producen correctamente glicoproteA�nas humanas bien de forma transitoria o bien de forma estable, pero el coste de la producciA?n es elevado en comparaciA?n con los sistemas procariotas debido al coste de materiales, a la densidad celular que pueden alcanzar los cultivos y al tiempo de generaciA?n celular, ya que una bacteria se divide mA?s de cincuenta veces en el tiempo en el que una cA�lula de mamA�fero se divide una vez.

Dentro de los sistemas procariotas, uno de los modelos de expresiA?n mA?s utilizados ha sido Escherichia coli. El A�xito de Escherichia coli se basa principalmente en; i) la facilidad de manipulaciA?n del DNA; ii) el elevado nA?mero de mutantes y vectores de expresiA?n disponibles; iii) el amplio conocimiento de la fisiologA�a de la cA�lula, que permite alcanzar densidades celulares elevadas con un medio de cultivo econA?mico, y; iv) el conocimiento del efecto de la sobreexpresiA?n de proteA�nas sobre la bacteria. Sin embargo, Escherichia coli presenta ciertos inconvenientes en la sA�ntesis de proteA�nas recombinantes: i) no lleva a cabo procesamientos post-transduccionales propios de cA�lulas eucariotas, como es el caso de la glicosilaciA?n o fosforilaciA?n, lo cual afecta a la estructura, estabilidad, solubilidad y actividad biolA?gica de la proteA�na producida; ii) carece de chaperonas (proteA�nas de plegamiento) adecuadas para permitir un plegamiento correcto de las proteA�nas recombinantes; iii) y no forma puentes disulfuro en el citoplasma, salvo en ciertas cepas mutantes(4).

Para producir proteA�nas recombinantes en Escherichia coli es necesario que las cA�lulas dispongan de un mecanismo capaz de procesar la informaciA?n genA�tica que codifica para la proteA�na de interA�s, bien sea industrial o farmacA�utico, y permitir asA� producir grandes cantidades de dicha proteA�na. El conjunto de organismo hospedador y elementos de procesamiento de la expresiA?n genA�tica para la sA�ntesis proteica recibe el nombre de sistema de expresiA?n.

Sistemas de expresiA?n en Escherichia coli

En general, un sistema de expresiA?n consiste en un conjunto de elementos genA�ticos configurados de manera A?ptima para el control de la transcripciA?n y traducciA?n de las secuencias a expresar(5,6). El sistema de expresiA?n en Escherichia coli estA? constituido por dos componentes: una bacteria huA�sped y un vector de expresiA?n que posee los elementos gA�nicos necesarios para realizar los procesos de transcripciA?n y traducciA?n en dicha bacteria. Respecto al vector de expresiA?n es preciso tener en cuenta varios criterios con el fin de obtener una expresiA?n eficiente: el origen de replicaciA?n, que influye en el nA?mero mA?ximo de copias del vector de expresiA?n por cada cA�lula, las caracterA�sticas de las secuencias de inicio y final de la transcripciA?n, entre las que se incluyen los promotores y terminadores, las seA�ales de comienzo de la traducciA?n, como son el codA?n de inicio de la traducciA?n y los sitios de uniA?n al ribosoma, la localizaciA?n subcelular de la proteA�na que se va a expresar (citoplasma o periplasma) y el control de la segregaciA?n plasmA�dica. En la segregaciA?n plasmA�dica es de gran importancia el mecanismo de retenciA?n del vector en la cA�lula. El mecanismo clA?sico para evitar el inconveniente de la segregaciA?n es la coexpresiA?n en el vector de un gen codificante para la resistencia a un marcador de selecciA?n, generalmente un antibiA?tico, de manera que A?nicamente la cA�lulas que posean en su interior el vector serA?n capaces de propagarse en un medio de cultivo que contenga el marcador de selecciA?n. Otro mecanismo que previene la pA�rdida del vector y evita el uso de antibiA?ticos es la inclusiA?n en el vector de regiones cromosA?micas que complementen la auxotrofA�a de una determinada cepa bacteriana(7), es decir, A?nicamente las cA�lulas que contengan el vector serA?n capaces de crecer en un medio de cultivo que carezca del elemento para el que la cepa es auxA?trofa.

La cepa de Escherichia coli mA?s utilizada en los sistemas de expresiA?n es la BL21, debido a que es defectiva en las proteasas OmpT y Lon, involucradas en la degradaciA?n de proteA�nas. En funciA?n del sistema de expresiA?n empleado, la cepa puede contener el mA?dulo regulador de la expresiA?n integrado en el cromosoma. En el caso concreto de los sistemas de expresiA?n pET (Novagen) y pRSET (Invitrogen) la cepa de expresiA?n contiene el ADN del bacteriA?fago DE3 integrado en el cromosoma. Este bateriA?fago contiene a su vez el gen codificante de la T7 RNA polimerasa regulado por el promotor lacUV5 cuya actividad se induce por medio de la adiciA?n del inductor IPTG (Isopropyl-?-D-thiogalactopyranoside). En este sistema, el vector de expresiA?n pET utilizado para la expresiA?n de la secuencia codificante de la proteA�na de interA�s, incorpora una regiA?n promotora reconocida por la T7 RNA polimerasa, de manera que tras la adiciA?n del IPTG, la T7 RNA polimerasa expresada desde el cromosoma bacteriano induce la expresiA?n de la proteA�na a partir del vector. En el caso de los sistemas pGEX (GE Healthcare), pQE (QIAGEN), pTrc (Invitrogen), pBAD (Invitrogen) la expresiA?n de las proteA�nas recombinantes no estA? supeditada a la presencia de un mA?dulo regulador integrado en el cromosoma de la bacteria. En estos casos, los elementos reguladores del promotor para la expresiA?n de proteA�nas recombinantes estA?n incluidos en el vector, por lo que el mismo vector puede emplearse en combinaciA?n con diferentes cepas.

En la Tabla 1 se resumen los sistemas de expresiA?n comerciales comA?nmente utilizados para la expresiA?n de proteA�nas recombinantes en Escherichia coli.

En general, la producciA?n de proteA�nas recombinantes para investigaciA?n bA?sica e industrias farmacA�uticas se ha basado en la amplificaciA?n gA�nica mediante sistemas de expresiA?n con promotores fuertes regulados por represores que controlan el nivel basal de expresiA?n. Sin embargo, recientemente se ha desarrollado un sistema de expresiA?n novedoso y alternativo basado en un circuito de expresiA?n en cascada que no requiere el consumo de energA�a metabA?lica para reprimir la expresiA?n basal de la proteA�na recombinante y que se activa tras la adiciA?n del inductor salicilato y derivados del benzoato, mucho mA?s econA?micos que el tradicionalmente utilizado IPTG, empleado como inductor en el sistema pET.

Sistema en Cascada o Circuito en cascada de expresiA?n

El sistema de expresiA?n en cascada consiste en un circuito de expresiA?n gA�nica constituido por un mA?dulo de regulaciA?n localizado en el cromosoma de la bacteria huA�sped y un mA?dulo de expresiA?n que puede estar contenido en un plA?smido extracromosomal o bien integrado en el cromosoma de la bacteria.

El mA?dulo de expresiA?n insertado en el cromosoma de la bacteria estA? formado por el gen codificante para la proteA�na NahR, el promotor diana de NahR, Psal, y el gen codificante de la proteA�na XylS bajo la regulaciA?n del promotor Psal. La proteA�na NahR es un activador transcripcional positivo codificado por el gen nahR, necesario para la activaciA?n de dos operones involucrados en el catabolismo de naftaleno en Pseudomonas putida(8,9). La proteA�na NahR, activada por el inductor natural salicilato, promueve la expresiA?n de genes controlados por el promotor diana Psal(10). El otro miembro del mA?dulo de regulaciA?n es la proteA�na XylS que pertenece a la familia AraC de reguladores transcripcionales involucrada en el control de la expresiA?n de genes relacionados con la virulencia, estrA�s y metabolismo en Pseudomonas putida. XylS es un activador transcripcional de Pm, un promotor que controla la expresiA?n de los componentes de la vA�a de catabolismo del benzoato y alquilbenzoato localizados en el plA?smido pTOL de Pseudomonas putida(11).

Por otra parte, el mA?dulo de expresiA?n estA? formado por el promotor Pm regulado por el factor de transcripciA?n XylS, y el gen de interA�s codificante para la proteA�na a expresar. Este mA?dulo de expresiA?n se puede disponer en dos configuraciones: bien formar parte de un plA?smido autoreplicativo o bien como integraciA?n cromosA?mica en la bacteria huA�sped. En el caso del plA?smido como vehA�culo portador del mA?dulo de expresiA?n es necesario ejercer una presiA?n de selecciA?n para evitar la segregaciA?n plasmA�dica, generalmente con un antibiA?tico. Por el contrario, en la versiA?n integrativa el mA?dulo de expresiA?n no requiere el uso de antibiA?ticos para retener el vector en la cA�lula pero el nivel de expresiA?n es significativamente inferior.

La acciA?n coordinada de todos los elementos constituyentes del circuito de cascada transcripcional conducen a la amplificaciA?n de la expresiA?n de la proteA�na recombinante de interA�s industrial o farmacA�utico. El circuito se inicia en presencia de un agente quA�mico activador de la proteA�na NahR, como por ejemplo el activador natural salicilato. El salicilato o algunos derivados aromA?ticos del mismo se unen a la regiA?n central de la proteA�na activA?ndola. La proteA�na NahR activa se une al promotor diana Psal y promueve la amplificaciA?n transcripcional(12) del gen xylS. Finalmente, la proteA�na codificada por este gen, XylS, activa la expresiA?n del gen de interA�s regulado por el promotor Pm de dos maneras alternativas: por aumento de los niveles intracelulares del regulador XylS o bien por la presencia del agente quA�mico activador de XylS, como es el caso del benzoato o derivados(11). Recientemente se ha descrito un posible mecanismo de funcionamiento de la uniA?n del regulador XylS al promotor Pm, en el que se indica que XlyS se une a regiones promotoras de Pm en forma de dA�meros y que la formaciA?n de estos dA�meros es consecuencia de la uniA?n de un agente quA�mico activador (benzoato o derivados) o por incremento de la concentraciA?n proteica de XylS por encima de un valor umbral(11). En la Figura 1 de la pA?gina anterior se muestra un esquema del funcionamiento del sistema en Cascada y del sistema pET.

(|Figura 1. RepresentaciA?n esquemA?tica del mA?dulo de regulaciA?n y del mA?dulo de expresiA?n del sistema de expresiA?n en Cascada (A) y del sistema de expresiA?n pET (B).
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Como se ha mencionado, el funcionamiento del sistema en cascada requiere el uso de dos compuestos quA�micos activadores de las proteA�nas NahR y XylS, salicilato y benzoato o derivados, respectivamente. Sin embargo, se ha estudiado la posibilidad de activaciA?n de las proteA�nas NahR y XylS con un A?nico agente quA�mico. Como resultado se han obtenido versiones modificadas de NahR y XylS que responden a la acciA?n de un A?nico activador quA�mico, bien salicilato, bien benzoato(10,12). Este aspecto ha sido desarrollado y comercializado como un sistema en cascada activado exclusivamente con salicilato en el que el mA?dulo regulador estA? constituido por XylS2, un mutante de XylS(12), en lugar del regulador XylS nativo(13). Sin embargo, en nuestros laboratorios hemos observado, mediante ensayos de reacciA?n en cadena de la polimerasa (PCR) y posterior secuenciaciA?n del producto amplificado, que el gen que codifica para XylS2 no estA? presente en el mA?dulo regulador portado en las cepas comerciales de expresiA?n del sistema en cascada, sino que el gen contenido es el gen nativo, xylS, insensible a la acciA?n del salicilato. En nuestros laboratorios hemos caracterizado el sistema de expresiA?n utilizando las cepas comerciales portadoras del mA?dulo regulador de la expresiA?n proteica: MPO12, REG-1, y una tercera cepa no comercial: Medal Fold. MPO12 es una cepa de E. coli K-12 silvestre resistente a rifampicina(14), REG-1 es una cepa E. coli K-12 con el genotipo similar a la cepa de clonaciA?n TOP10 (Invitrogen), y Medal Fold es una cepa E. coli derivada de BL21 C41 (DE3) deficiente en las proteasas OmpT y Lon, y que ademA?s contiene una mutaciA?n adicional no caracterizada que aumenta los niveles de expresiA?n de proteA�nas de membrana y tA?xicas(15).

En primer lugar, utilizando la cepa MPO12, que incorpora el mA?dulo regulador del circuito en cascada de expresiA?n gA�nica, y un plA?smido que contiene el mA?dulo de expresiA?n y un gen codificante para una proteA�na terapA�utica, hemos desarrollado un mA�todo de cultivo discontinuo en biorreactor y un medio de cultivo definido que permite a esta cepa crecer hasta densidades A?pticas superiores a 200 unidades de absorbancia a 600 nm, equivalente a 300 gramos de biomasa por litro de cultivo, aproximadamente. Sin embargo, la inducciA?n con salicilato de la expresiA?n de la proteA�na de interA�s en ese mismo sistema de expresiA?n cuando el cultivo alcanzA? una densidad A?ptica de 146 unidades, dio lugar A?nicamente a un 4 % de proteA�na de interA�s respecto a la proteA�na total. Este bajo rendimiento de la expresiA?n se explicarA�a por el desacoplamiento de la supuesta inducciA?n en cascada por efecto del salicilato. Debido a que el salicilato A?nicamente es capaz de activar el primer elemento del mA?dulo regulador del sistema en cascada y XylS es dependiente del benzoato o derivados, serA�a posible incrementar el rendimiento combinando los agentes quA�micos activadores de los dos elementos del mA?dulo regulador. Para ello, hemos realizado una serie de experimentos utilizando una proteA�na modelo, GFP (green fluorescent protein), contenida en un plA?smido multicopia y una cepa que tiene el mA?dulo regulador del sistema de expresiA?n integrado en el cromosoma. En estos ensayos hemos aplicado distintas combinaciones de inductores de los reguladores NahR y XylS para inducir la expresiA?n de la proteA�na GFP. Como se observa en la Figura 2 cuando aumenta la concentraciA?n de salicilato se observa un incremento en el nivel de expresiA?n de GFP. El mismo resultado se registra cuando aumenta la concentraciA?n de un derivado del benzoato. Asimismo, la combinaciA?n de los dos inductores genera un nivel de expresiA?n de GFP superior al efecto producido por la suma de los efectos producidos por los inductores cuando se adicionan por separado, lo cual indica que la combinaciA?n de los inductores tienen un efecto sinA�rgico sobre la expresiA?n de la proteA�na ensayada.

(|Figura 2. CinA�tica de inducciA?n de la expresiA?n de la proteA�na GFP con varias combinaciones de los inductores del sistema de expresiA?n en Cascada.
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Una vez demostrada la capacidad de expresiA?n del sistema en cascada y comprobado el efecto sinA�rgico de la combinaciA?n de los agentes quA�micos inductores sobre la expresiA?n de la proteA�na GFP, aplicamos el circuito de cascada transcripcional a dos proteA�nas de interA�s biofarmacA�utico. Los genes codificantes para ambas proteA�nas se subclonaron en sendos plA?smidos de expresiA?n bajo el control del promotor Pm, constituyendo el mA?dulo de expresiA?n. A continuaciA?n, los plA?smidos generados se trasformaron por separado en una cepa portadora del mA?dulo regulador del sistema en cascada y se llevA? a cabo, en paralelo, una cinA�tica de inducciA?n de la expresiA?n de las dos proteA�nas tras adiciA?n de diferentes concentraciones de los inductores salicilato y un derivado del benzoato. Como se puede observar en la Figura 3 la combinaciA?n de los activadores de NahR y XylS generan niveles de expresiA?n superiores a los detectados con salicilato A?nicamente. AdemA?s, se obtienen niveles de expresiA?n entre 20 y 25 % de la proteA�na de interA�s respecto a la proteA�na total expresada por las bacterias. Estos niveles de expresiA?n son comparables a los niveles obtenidos con el sistema de expresiA?n pET y pRSET.

(|Figura 3. CinA�tica de inducciA?n de la expresiA?n de la proteA�na recombinante a tiempo 0, 3 y 5 hora tras la adiciA?n del inductor salicilato, un derivado del benzoato y distintas combinaciones de ambos inductores del sistema en Cascada.|)

En la actualidad, DRO Biosystems estA? llevando a cabo una serie de mejoras del sistema de expresiA?n en cascada en la cepa y el plA?smido de expresiA?n. En la configuraciA?n del sistema de expresiA?n utilizado hasta el momento la retenciA?n del plA?smido se consigue por medio de antibiA?ticos como elementos de presiA?n selectiva, lo que supone un inconveniente durante el desarrollo de un proceso de producciA?n de un fA?rmaco destinado al consumo humano. El uso de antibiA?ticos se puede evitar mediante la creaciA?n de una auxotrofA�a en la cepa de expresiA?n para un determinado componente esencial de la cA�lula, como es el caso de un aminoA?cido. Gracias a la mejora en las tA�cnicas de ADN recombinante dedicadas a la manipulaciA?n genA�tica es posible la interrupciA?n de un determinado gen o regiA?n cromosA?mica bacteriana mediante un mA�todo sencillo basado en la recombinaciA?n homA?loga(16). La auxotrofA�a generada en la cepa de expresiA?n puede ser complementada en el plA?smido de expresiA?n por la regiA?n cromosA?mica nativa que ha sido modificada, de forma que solo las cA�lulas portadoras del plA?smido de expresiA?n con la secuencia de complementaciA?n podrA�an crecer en un medio de cultivo carente del elemento para el que la cepa es auxA?trofa.

Por otra parte, tambiA�n se estA? mejorando el plA?smido de expresiA?n utilizando como base plA?smidos de nA?mero de copias controlado para incrementar el rendimiento en proteA�na de intA�res por cA�lula, evitar el empleo de antibiA?ticos como agentes de selecciA?n y con un sitio de clonaje mA?ltiple mA?s completo para facilitar el proceso de subclonaciA?n de la secuencia de interA�s. BM

Notas

1. Wildt, S.; Gerngross, T.U. Nat Rev Microbiol, 2005, 3(2), 119-28.

2. Hamilton, S.R.; Davidson R.C.; Sethuraman N.; Nett J.H.; Jiang Y.; Rios S.; Bobrowicz P.; Stadheim T.A.; Li H.; Choi B.K.; Hopkins D.; Wischnewski H.; Roser J.; Mitchell T.; Strawbridge R.R.; Hoopes J.; Wildt S.; Gerngross T.U. Science, 2006, 313(5792), 1441-3.

3. Jarvis, D.L. Virology, 2003, 310(1), 1-7.

4. de Marco, A. Microb Cell Fact, 2009 14;8:26.

5. Makrides, S.C. Microbiol Rev, 1996, 60(3), 512-38.

6. SA?rensen, H.P.; Mortensen, K.K. J Biotechnol, 2005, 115(2), 113-28.

7. Vidal, L.; Pinsach, J.; Striedner, G.; Caminal, G.; Ferrer, P. J Biotechnol, 2008, 134(1-2):127-36.

8. Schell, M.A.; Poser, E.F. J Bacteriol, 1989, 171, 837-846.

9. Park, W.; Padmanabhan, P.; Padmanabhan, S.; Zylstra, G.J.; Madsen, E.L. Microbiology, 2002, 148(Pt 8), 2319-29.

10. Cebolla, A.; Sousa, C.; de Lorenzo V. J Biol Chem, 1997, 272(7), 3986-92.

11. DomA�nguez-Cuevas, P.; MarA�n, P.; Busby, S.; Ramos, J.L.; MarquA�s, S. J Bacteriol, 2008, 190(9), 3118-28.

12. Ramos, J.L.; Michan C.; Rojo, F.; Dwyer, D.; Timmis K. J Mol Biol, 1990, 211(2), 373-82.

13. Patente ES 2 228 541 T3

14. Royo, J.L.; Moreno-Ruiz, E.; Cebolla, A.; Santero, E. J Biotechnol, 2005, 116(2), 113-24.

15. Miroux, B.; Walker, J.E. J Mol Biol, 1996, 260, 289-298.

16. Datsenko, K.A.; Wanner, B.L. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000, 97(12), 6640